Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3002
Main Title: Charakterisierung und Stabilisierung der löslichen Hydrogenase aus Ralstonia eutropha H16 für den technischen Einsatz bei der reduktiven Cofaktorregenerierung
Translated Title: Characterisation and stabilisation of the soluble hydrogenase from Ralstonia eutropha H16 for technical application in a reductive cofactor regeneration
Author(s): Ratzka, Juliane
Advisor(s): Ansorge-Schumacher, Marion B.
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Die lösliche Hydrogenase aus Ralstonia eutropha H16 (SH) ist aufgrund ihrer Bidirektionalität und ihrer Toleranz gegenüber Sauerstoff ein vielversprechender Biokatalysator zur Regenerierung des Cofaktors NADH. In diesem Zusammenhang wurde das Potential dieses Enzyms für eine entsprechende Anwendung ermittelt und bewertet. Dazu wurde zunächst der Einfluss verschiedener technisch relevanter Parameter, u.a. die Temperatur, der pH und unkonventioenelle Cosolventien, auf die Aktivität und Stabilität der SH systematisch untersucht. Im Rahmen dieser Studien zeigte das Enzym eine ausgeprägte Sensitivität, insbesondere gegenüber verschiedenen Konzentrationen von Cosolventien wie organische Lösungsmittel und ionische Flüssigkeiten, die aufgrund ihrer löslichkeitsvermittelnden Eigenschaften in einer Vielzahl technischer Anwendungen benötigt werden. Auf Basis dieser Resultate wurde die SH mittels der chemischen Modifizierung mit Methoxypolyethylenglykol sowie der adsorptiven und kovalenten Immobilisierung auf Amberlite FPA54 stabilisiert. Dabei konnten Stabilisierungsfaktoren von bis zu 6 in rein wässrigen Lösungen bei optimalen Aktivitätsbedingungen und unter mechanischer Beanspruchung erzielt werden. In Gegenwart der untersuchten organischen Lösungsmittel ließ sich die Stabilität der SH um Faktoren von bis zu 159 erhöhen. Zudem führte die Immobilisierung des Enzyms zu Stabilisierungsfaktoren von bis zu 17 in den gewählten ionischen Flüssigkeiten. Schließlich wurde die SH in ihrer nativen sowie in ihren stabilisierten Formen als NADH-Regenerierungskatalysator in Kopplung mit der Carbonylreduktase aus Candida parapsilosis (CPCR) eingesetzt. Die dabei gemessenen Reaktionsumsätze und die berechneten total turnover numbers (TTN: nProdukt/nEnzym) wurden direkt mit denen der üblich verwendeten Formiatdehydrogenase aus Candida boidinii (FDH) verglichen. Dabei konnte die SH annähernd vollständige Reaktionsumsätze erzielen und eine TTN von bis zu 143666. Diese TTN war beachtlich höher als die der FDH. Des Weiteren wurde die immobilisierte SH rezykliert und bei einer zweiten Cofactorregenerierung eingesetzt. Dabei konnten bei der Durchführung der zweiten Reaktion ähnlich hohe Reaktionsumsätze wie bei der ersten Reaktion erzielt werden.
The oxygen-tolerant soluble hydrogenase from Ralstonia eutropha H16 (SH) reveals promising properties for a technical application as a regeneration catalyst for the cofactor NADH, which is required in numerous organic syntheses. In this context, the actual potential of this enzyme for an accordant application was studied and evaluated. Therefore, the influence of various technical relevant parameters including temperature, pH, salts and unconventional co-solvents on catalytic activity and stability of the SH was systematically investigated. These studies obtained a strong sensitivity of this enzyme, especially against the presence of various concentrations of co-solvents including organic solvents and ionic liquids, which are often required as solubilisers in various technical applications. Based on these results, the SH was stabilised by chemical modification with methoxy-poly(ethylene) glycol (mPEG) as well as by adsorptive and covalent immobilisation on Amberlite FPA54 resin. Thereby, stabilisation factors of up to 6 were achieved in pure aqueous solutions at optimum reaction conditions and under mechanical stress. In the presence of the studied organic solvents the enzyme stability could even be increased by a factor of up to 159. In addition, the immobilisation distinctly improved SH stability in the presence of the investigated ionic liquids achieving stabilisation factors of up to 17. Finally, the SH was applied in its native as well as in its stabilised form as NADH regeneration catalyst in combination with the carbonyl reductase from Candida parapsilosis (CPCR). The thereby measured reaction conversions and calculated total turnover numbers (TTN: nproduct/nenzyme) were directly compared to those of the commonly used formate dehydrogenase from Candida boidinii (FDH). Thereby, the SH was able to achieve an almost complete reaction conversion and TTN of up to 143,666. This was distinctly superior compared to the FDH. Futhermore, the immobilised enzyme was recycled and applied in a second cofactor regeneration reaction. Thereby, in the second reaction the immobilised SH achieved almost as high reaction conversions as in the first performed reaction.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-32913
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/3299
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3002
Exam Date: 19-Oct-2011
Issue Date: 1-Nov-2011
Date Available: 1-Nov-2011
DDC Class: 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Subject(s): Cofaktorregenerierung
Hydrogenase
Immobilisierung
Modifizierung
Cofactor regeneration
Hydrogenase
Immobilisation
Modification
Usage rights: Terms of German Copyright Law
Appears in Collections:Technische Universität Berlin » Fakultäten & Zentralinstitute » Fakultät 2 Mathematik und Naturwissenschaften » Institut für Chemie » Publications

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Dokument_18.pdf1,01 MBAdobe PDFThumbnail
View/Open


Items in DepositOnce are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.