Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3008
Main Title: Analyse von Herkunft und funktioneller Aktivität humaner membranständiger Glucocorticoidrezeptoren
Translated Title: Analysis of origin and functional activity of membrane bound glucocorticoid receptors
Author(s): Strehl, Cindy
Advisor(s): Lauster, Roland
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Hintergrund/Ziele: Glucocorticoide (GC) gehören zu den am häufigsten verschriebenen Medikamenten für die Behandlung einer Vielzahl von rheumatischen oder anderen entzündlichen Erkrankungen. Ihre anti-entzündliche und immunsupprimierende Wirkung wird vornehmlich durch die sogenannten genomischen Mechanismen, also über den cytosolischen Glucocorticoidrezeptor (cGCR) vermittelt. Aber es existieren auch schnelle GC-Effekte, die durch spezifische und unspezifische nicht-genomische Mechanismen vermittelt werden. Es wird angenommen, dass der membranständige Glucocorticoidrezeptor (mGCR) bei den spezifischen, nicht-genomischen GC-Effekten eine wichtige Rolle spielt. Hierzu wurde beispielsweise gezeigt, dass der mGCR auf Monozyten von Patienten mit entzündlichen Erkrankungen, wie beispielsweise der Rheumatoiden Arthritis, hochreguliert wird und die Expressionsfrequenz mit der Krankheitsaktivität positiv korreliert. Veränderte Expressionen des mGCRs wurden im Vergleich zu Gesunden auch für andere entzündliche Erkrankungen, wie dem systemischen Lupus erythematodes, der ankylosierenden Spondylitis oder nach Impfungen gezeigt. Daher wurde eine klinische Relevanz des mGCRs vermutet, jedoch sind sowohl dessen Herkunft als auch seine funktionelle Aktivität ungeklärt und deshalb Ziel dieser Studie. Methoden/Feststellungen: Die Herkunft des mGCRs wurde mittels der RNA-Interferenz Technologie untersucht. Dafür wurden mGCR positive HEK293T Zellen mit GCR-siRNA transfiziert. Die Effektivität der RNAi-vermittelten GCR Reduktion wurde auf mRNA Ebene mittels RT-qPCR überprüft und die Reduktion der cGCR Proteinmenge über Immunoblot-Analyse nachgewiesen. Die Analyse der mGCR Expression mittels hochsensitiver Immunfluoreszenz zeigte jedoch, dass eine transiente Reduktion der GCR mRNA nicht zu einer Verminderung der mGCR Expression führt. Im Gegensatz dazu führte eine stabile Herabregulation der GCR mRNA mittels shRNA Technologie zu einer signifikant verminderten mGCR Expression. Für die Analyse der funktionellen Aktivität der mGCR wurden humane CD14+ Monozyten für 24h mit LPS stimuliert, um die mGCR Expression auf bis zu 70% zu erhöhen. Im Anschluss daran wurden die Zellen mit der membranimpermeablen Substanz Dexamethason-BSA (Dex-BSA), mit Dexamethason oder BSA allein behandelt. Um schnelle Effekte mittels Kinom-Analyse zu identifizieren, wurde eine kurze Inkubationszeit von 20min gewählt. Für die Genom-Analyse wurde eine zusätzliche Inkubation von 3h angeschlossen. Die Kinom-Analyse wurde mit Hilfe der PepChip™ Technik durchgeführt und zeigte, dass durch Dex-BSA schnelle (De)Phosphorylierungsprozesse über Kinasen induziert werden. Es wurden einige MAP-Kinasen, wie z.B. die p38 MAPK identifiziert, welche durch Dex-BSA verstärkt phosphoryliert wurden. Die Genom-Analyse mittel Microarray offenbarte auch Effekte des Dex-BSA auf die Genexpression. Eine Klassifizierung der identifizierten Gene in biologische Prozesse mit Hilfe der Panther Datenbank ergab, dass vor allem Prozesse der Signaltransduktion und des Metabolismus beeinflusst werden. Schlussfolgerungen/Relevanz: Diese Studie zur Analyse der Herkunft und der funktionellen Aktivität des mGCRs bewies erstmals, dass nur ein Gen existiert welches sowohl den cGCR als auch den mGCR codiert. Eine kurzzeitige Herabregulation der GCR mRNA beeinflusste die mGCR Expression nicht. Erst ein stabiler Knockdown zeigte einen Effekt auf die mGCR Expression. Daher kann zusätzlich geschlussfolgert werden, dass das mGCR Protein selbst eine lange Halbwertszeit bzw. eine hohe Stabilität aufweist. Durch Aktivierung des mGCRs mittels membranimpermeablen Dex-BSA konnte ebenfalls zum ersten Mal gezeigt werden, dass durch den mGCR Signale von außerhalb über schnelle (De)Phosphorylierungsprozesse mittels Kinasen in das Zellinnere weitergeleitet werden. Weiterhin konnte deutlich gemacht werden, dass die Aktivierung des mGCR auch einen Einfluss auf die Genexpression hat. Dadurch ist bewiesen, dass der mGCR tatsächlich funktionell aktiv ist. Der mGCR stellt daher ein interessantes Ziel für optimierte Behandlungsstrategien rheumatischer oder anderer entzündlicher Erkrankungen dar.
Background/Aims: Glucocorticoids (GC) are the most common used drugs in the treatment of a wide range of rheumatic and other inflammatory diseases. They exert their anti-inflammatory and immunosuppressive effects primarily via so called genomic mechanisms, thus mediated by the cytosolic glucocorticoid receptor (cGCR). However, rapid effects of GC exist, which are mediated by specific and unspecific non-genomic mechanisms. The membrane-bound glucocorticoid receptor (mGCR) has been suggested to play an important role by the mediation of specific non-genomic GC-action. It has already been shown, that mGCRs are up-regulated on monocytes of patients with inflammatory diseases, like rheumatoid arthritis, and that the frequency of mGCR expression positively correlates with the disease activity. Furthermore, modified mGCR expression has been shown for other inflammatory diseases like systemic lupus erythematosus, ankylosing spondylitis or after vaccination. Indeed, the clinical relevance of mGCR has been assumed, but the origin and functional activity remained unexplained and are in focus of this study. Methods/Results: The origin of the mGCR was investigated via RNA-interfence Technology. Therefore, mGCR positive HEK293T cells were transfected with GCR-siRNA. The efficacy was verified on mRNA level by RT-qPCR and the reduction of cGCR protein was investigated by immunoblot analysis. A transient reduction of the GCR mRNA does not decrease mGCR protein expression, as shown by high-sensitive immunofluorescent staining. In contrast, however, stable knockdown of GCR mRNA via shRNA technology showed a significantly diminished mGCR expression. For the analysis of the functional activity of mGCR, human CD14+ monocytes were stimulated with LPS for 24 hours in order to increase mGCR expression up to 70%. Subsequently, cells were treated with membrane-impermeable dexamethasone bound to BSA (Dex-BSA), Dexamethason or BSA alone. In order to identify rapid effect via kinome analysis, a short incubation time about 20 minutes was chosen. For a genome analysis, cells were incubated for additional 3 hours. Using the PepChip™ array technique, a Dex-BSA specific induction of rapid (de)phosphorylation processes mediated by different kinases has been shown. A number of MAP-kinases, including p38 MAPK, were identified to show an increased phosphorylation according to Dex-BSA treatment. A genome analysis via microarray also revealed that Dex-BSA altered gene expression. A functional classification into biological processes of identified genes via Panther database demonstrated that processes of signal transduction and metabolism are most affected. Conclusion: This study concerning the analysis of origin and functional activity of mGCR revealed for the first time, that there is only one gene encoding for both, the cGCR as well as for the mGCR. A transient knockdown of GCR mRNA showed no effect on mGCR expression, whereas a stabile knockdown affected mGCR expression. These results demonstrate that the mGCR protein owns a high stability due to its long half-life. Furthermore, an activation of mGCR by membrane-impermeable Dex-BSA revealed that external signals were transferred in the cell via rapid (de)phosphorylation processes by the mean of kinases. Additionally, it has been shown for the first time that an activation of the mGCR results in an altered gene expression. This is the evidence of the functional activity of the mGCR. mGCRs represent an interesting target for optimised treatment strategies in case of rheumatic or other inflammatory diseases.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-33006
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/3305
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3008
Exam Date: 24-Oct-2011
Issue Date: 4-Nov-2011
Date Available: 4-Nov-2011
DDC Class: 500 Naturwissenschaften und Mathematik
Subject(s): Glucocorticoid
Membran
Rezeptor
Glucocorticoid
Membrane
Receptor
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