Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3049
Main Title: Global Transcriptome Analysis of the Human Pathogens Chlamydia trachomatis and Chlamydia pneumoniae
Translated Title: Globale Transkriptomanalyse der Humanpathogene Chlamydia trachomatis und Chlamydia pneumoniae
Author(s): Albrecht, Marco
Advisor(s): Roland, Lauster
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Chlamydien sind obligat intrazelluläre humanpathogene Bakterien, welche einen einzigartigen zweiphasigen Lebenszyklus besitzen. Chlamydia trachomatis ist die häufigste Ursache für sexuell übertragbare Infektionen und Bindehautinfektionen die zur Erblindung führen. Chlamydia pneumoniae ist für ein breites Spektrum an akuten und chronischen Erkrankungen wie Atemwegsinfektionen und Atherosklerose verantwortlich. Chlamydien besitzen einen einzigartigen zweiphasigen Entwicklungszyklus, welcher zwischen infektiösen aber metabolisch inaktiven Elementarkörpern (EB) und nichtinfektiösen aber metabolisch aktiven Retikularkörpern (RB) alterniert. Es gibt bis heute keine Möglichkeit zur genetischen Manipulation von Chlamydien und keine Methode um Chlamydien außerhalb der Wirtszelle zu kultivieren. Deshalb stellt die Genomanalyse die Hauptmethode dar, um Einblicke in die Biologie der Chlamydiales zu erhalten. Obwohl die Genome von mehreren Stämmen bereits sequenziert wurden, sind sehr wenige Informationen über die Genstruktur dieser Bakterien bekannt. Die Genomsequenzen von C. trachomatis und C. pneumoniae sind seit 1998 beziehungsweise 1999 bekannt. Die Annotation des Genoms und der Großteil der Informationen über die Organisation des Transkriptoms basiert auf vergleichenden computergestützten Analysen und Vorhersagen. Durch die Einführung von Hochdurchsatz-Sequenziermethoden wurde die globale Transkriptomanalyse revolutioniert. In dieser Arbeit wurde eine Methode zur differentiellen RNA-Sequenzierung (dRNA-seq) angewendet, welche eine enzymatische Anreicherung von Primärtranskripten verwendet, um das primäre Transkriptom von aufgereinigten RB sowie EB der beiden Stämme C. trachomatis L2b und C. pneumoniae CWL029 zu bestimmen. Mit dieser dRNA-seq-Technik ist es möglich, primäre Transkriptionsstartstellen (TSS) von annotierten Genen zu bestimmen, sowie neue Gene, wie kleine nicht-codierende RNAs, zu entdecken. Diese Kartierung der TSS ist mit einer Auflösung bis zu einem Nukleotid möglich. Durch Hochdurchsatzsequenzierung wurden experimentell detaillierte Transkriptomkarten der beiden Chlamydien-Spezies geschaffen. Für C. trachomatis konnten 363 TSS von annotierten Genen bestimmt werden. Durch semiquantitative Analyse der kartierten cDNA Sequenzen wurden 84 in EB und RB differentiell exprimierte Gene bestimmt. Weiterhin konnten 42 genom- und eine plasmid-kodierte kleine nicht-kodierende RNA entdeckt und teilweise experimentell durch Northern Blotting verifiziert werden. Die genomkodierte nichtkodierende RNA Ctr0332 war eine der am stärksten exprimierten und differentiell exprimierten Transkripte, was auf eine Rolle im Entwicklungszyklus von C. trachomatis hindeutet. Bei der Analyse von C. pneumoniae wurden 565 TSS sowie 246 polycistronische Transkripte bestimmt. Außerdem wurde eine Vielzahl an Transkripten in intergenischen Regionen und antisense zu annotierten Genen entdeckt, die potentielle nichtkodierende RNAs darstellen. Diese wurden teilweise durch Northern Blotting verifiziert. Durch diesen experimentellen Ansatz der Hochdurchsatzsequenzierung wurde für insgesamt 861 der 1074 annotierten Gene (entspricht 80%) von C. pneumoniae entweder eine primäre TSS oder eine Zugehörigkeit zu einem Operon identifiziert. Basierend auf diesem Transkriptom-Datensatz konnte die Annotation für eine Reihe von Genen korrigiert werden. Eine Analyse von differentiell regulierten Genen zeigte, dass über 50 Gene in EB angereichert sind, die meisten mit völlig unbekannter Funktion. Durch die experimentelle Bestimmung der TSS war es möglich, die Promotorsequenzen von 531 proteinkodierenden Genen zu analysieren. Diese Analyse zeigte, dass die Mehrheit der Gene durch den Standardsigmafaktor erkannt wird und es bei den untersuchten Chlamydien keine stark konservierten Promotormotive für alternative Sigmafaktoren gibt. Dieser detaillierte Datensatz der primären TSS sowie der Operonstrukturen leistet einen fundamentalen Beitrag zum Verständnis der Genorganisation und -funktion dieser wichtigen Humanpathoge. Er bildet eine wertvolle Grundlage für zukünftige Untersuchungen der Genkontrolle. Dies ist die erste Arbeit, welche die differentiellen Transkriptome von aufgereinigten EB und RB untersucht hat. Die Ergebnisse können helfen den einzigartigen und bisher größtenteils unbekannten Konversionsmechanismus zwischen den beiden Entwicklungszyklusformen zu verstehen.
Chlamydia are obligate intracellular pathogenic bacteria that share a unique biphasic life cycle. Chlamydia trachomatis is the most common bacterial cause of sexually transmitted infections and blinding trachoma. Chlamydia pneumoniae is responsible for a wide range of acute and chronic diseases, including respiratory infections and atherosclerosis. Chlamydia share a unique bi-phasic life cycle that switches from infectious but metabolically inactive elementary bodies (EB) to non-infectious but metabolically active reticular bodies (RB). Since genetic tools to manipulate the genome and methods to culture the bacteria outside the host cell are lacking, genome sequence analysis has been the main approach to get insight into the biology of all Chlamydiales. Although the genomes of several strains have been sequenced yet, very little information is available on the gene structure of these bacteria. The genome sequences of C. trachomatis and C. pneumoniae are available since 1998 and 1999, respectively. Genome annotation and most information on transcript organisation are based on comparative computational approaches. Massively parallel cDNA sequencing has revolutionized global transcriptome analysis in recent years. Here, a differential RNA-sequencing (dRNA-seq) approach is applied that uses enzymatic enrichment for primary transcripts to define the transcriptome of purified elementary bodies (EB) and reticulate bodies (RB) of the strains C. trachomatis L2b and C. pneumoniae CWL029, respectively. Using dRNA-seq technique, primary transcriptional start sites (TSS) of annotated genes and novel genes like small non-coding RNAs could be mapped in a thus far unprecedented resolution as a complement to the genome sequence. By massive parallel sequencing a detailed map of the transcriptomes of two Chlamydia species was generated experimentally. For C. trachomatis 363 transcriptional start sites (TSS) of annotated genes could be determined. Semi-quantitative analysis of mapped cDNA reads revealed differences in the RNA levels of 84 genes isolated from EB and RB, respectively. Furthermore, 42 genome- and 1 plasmid-derived novel non-coding RNAs were discovered and in part validated by Northern blotting. The genome encoded non-coding RNA, ctrR0332, was found to be one of the most abundant and differentially expressed transcripts in EB and RB, implying an important role in the developmental cycle of C. trachomatis. 565 transcriptional start sites and 246 polycistronic transcripts could be determined for C. pneumoniae. Furthermore, numerous transcripts in intergenic regions and antisense to annotated ORFs which encode putative non-coding RNAs were identified and in part verified by Northern hybridisation. Most of them are cis- or trans-encoded non-coding RNAs. By experimental methods a distinct TSS or an affiliation to an operon could be identified for 861 out of 1074 genes (80%) of C. pneumoniae. Based on the transcriptome sequencing data the annotation of several genes could be corrected. An analysis of differentially expressed genes identified more than 50 genes to be more abundant in EB, most of them with unknown function. Based on the experimentally verified TSS the promoter sequences of 531 genes were analysed for common motifs. This analysis revealed a standard sigma factor binding site whereas alternative sigma factor binding sites are not conserved among Chlamydia. This detailed catalogue of TSS and operon structure will help to understand the organization, control and function of genes of these important pathogens. It is valuable information for further analysis of gene regulation. This is the first study that differentially analysed transcriptomes of purified EB and RB which will help to understand the regulation of the unique, yet unknown, conversion mechanisms between the two life cycle forms.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-30660
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/3346
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3049
Exam Date: 16-May-2011
Issue Date: 9-Dec-2011
Date Available: 9-Dec-2011
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): Chlamydia
Sequenzierung
Transkriptom
Chamydia
Sequencing
Transcriptome
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