Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3088
Main Title: Biophysikalische Charakterisierung des Cl‐/H+‐Austauschers ClC‐7
Translated Title: Biophysical characterization of the Cl-/H+ exchanger ClC-7
Author(s): Leisle, Lilia
Advisor(s): Friedrich, Thomas
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: ClC-7 ist ein nahezu ubiquitär exprimiertes, spät-endosomales/lysosomales Säuger-CLC-Protein von tragender Bedeutung für die intra-lysosomale Cl--Akkumulation und für die Ansäuerung von Resorptionslakunen in Osteoklasten. Ostm1 ist bekannt als seine Hilfsuntereinheit. So führen Mutationen in beiden Proteinen zu lysosomalen Speicherkrankheiten und Osteopetrose. Die intrazelluläre Lokalisation dieses Cl-/H+-Austauschers verwehrte seine biophysikalische Untersuchung. Durch Mutation einiger Erkennungssequenzen für die zelluläre Sortierungsmaschinerie ist eine partielle Umleitung des Proteins zur Plasmamembran gelungen und ermöglichte den elektrischen Zugang über elektrophysiologische Standardmessmethoden. So konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit ClC-7 als letztes Mitglied der Säuger-CLCs einer biophysikalischen Grundcharakterisierung unterzogen werden. ClC-7, genauer gesagt seine Plasmamembran-lokalisierte Mutante, ist ein langsam gesteuerter, auswärts-gerichteter 2Cl-/1H+-Austauscher, der nur unter Anwesenheit seiner Hilfsuntereinheit Ionen transportieren kann.Seine starke Zeitabhängigkeit unterscheidet ClC-7 von den restlichen intrazellulären Säuger-CLCs. Der Aktivierungsprozess läuft ca. zehn Mal langsamer ab als die Deaktivierung und ist auch fast zwei Mal stärker Temperatur-abhängig, was auf eine größere Konformationsänderung während der Aktivierung hinweist. In den vorliegenden Experimenten konnte unter keinen Bedingungen ein stationärer Zustand des Cl-/H+-Austausches erreicht werden. Die starke Spannungsabhängigkeit ist allen Säuger-CLC-Antiportern gemein. Hier konnte am Beispiel von ClC-7 zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Ionentranslokation durch den offenen Transporter nahezu linear von der elektrochemischen Triebkraft abhängig ist und dass somit die Rektifizierung dem Steuerungsverhalten des Proteins zu Grunde liegen muss. Es konnte ein V0,5 von 82 mV und eine Schaltladung von 1,32 bestimmt werden. Sowohl die Zeit- als auch die Spannungsabhängigkeit konnte wie bei den anderen CLCs durch Mutieren des gating-Glutamats, des molekularen Korrelats für das schnelle gate der CLCs, aufgehoben werden – es entstand eine pure, nahezu ohm‘sche Cl--Leitfähigkeit. Durch Mutation des intrazellulären H+-Akzeptors (Proton-Glutamat) wurde ebenfalls wie bei den anderen Säuger-CLC-Antiportern nicht nur der H+-Transport sondern auch der Anionen-Transport gänzlich unterbunden. Der Transport von extrazellulären Anionen wurde in folgender Reihenfolge präferiert: Cl- > Br- > NO3- > I-. Dabei konnte die Präferenz von Cl- über NO3- durch Substituieren des für die Selektivität verantwortlichen Serins (Sercen) mit einem Prolin umgekehrt werden, was bereits vorher an mehreren anderen CLCs demonstriert wurde. Die ClC-7-Transportaktivität konnte auch durch extrazelluläre Protonen moduliert werden. Während basische pHa-Werte die Stromamplitude erhöhten und die Aktivierungskinetik beschleunigten, bewirkten saure pHa-Werte das Gegenteil. Im Gegensatz zu einigen anderen CLCs konnte keine Abhängigkeit von ATP festgestellt werden. Neben der biophysikalischen Charakterisierung von ClC-7, die den Weg für weiterführende Struktur-Funktions-Studien ebnet, konnte durch diese Arbeit auch das Konzept des Spannungs-abhängigen Schaltverhaltens über Kanäle hinaus auf Transporter erweitert werden.
ClC-7 is a broadly expressed late-endosomal/lysosomal member of the mammalian CLC family with a pivotal role in lysosomal Cl- accumulation and acidification of the resorption lacuna of osteoclasts. It requires Ostm1 as a b-subunit to fulfill its physiological function. Mutations in either of the proteins lead to lysosomal storage disease and osteopetrosis. The strict intracellular localization of ClC-7 hitherto precluded its detailed biophysical characterization. Mutation of two N-terminal dileucin motifs in ClC-7, which mediate endosomal/lysosomal sorting of the protein resulted in plasma membrane expression of ClC-7 and thus made it accessible to standard electrophysiological methods enabling the first biophysical characterization of this exchanger. ClC-7 or more precisely its plasma membrane localized mutant is a slowly gated, outwardly rectifying 2Cl-/1H+ exchanger, which requires Ostm1 for transport activity. Its slow kinetics is a unique property among all intracellular mammalian CLCs. A steady state of the Cl-/H+ exchange was never reached under the present experimental conditions. The activation process is about ten times slower than the deactivation and about twice more dependent on temperature, indicating a larger conformational change during the activation. The strong voltage dependence is a common feature of all mammalian CLC exchangers. Here, we show for ClC-7 that the ion transport through the open exchanger is almost directly proportional to the electrochemical driving force, demonstrating that the rectification results from the gating process which is likely to be true for all intracellular mammalian CLCs. We determined a V0,5 of about 82 mV and a gating charge z of about 1.3. The voltage as well as the time dependence was eliminated upon neutralization of the gating glutamate, the molecular correlate of the protopore gate, and ClC-7 turned into a pure Cl- conductance of ohmic character in analogy to other mammalian CLCs. Mutating the intracellular proton acceptor, the proton glutamate, to alanine abolished like in other mammalian CLC exchangers the H+ as well as the Cl- transport. Furthermore, we determined for ClC-7 the anion preference sequence of Cl- > Br- > NO3- > I-. The Cl- over NO3- selectivity was reversed by mutating the serine of the selectivity filter into a proline as it was demonstrated before for several other CLCs. ClC-7 transport activity was also modulated by extracellular protons. Low extracellular proton concentration increased the current amplitudes and high extracellular proton concentrations had the opposite effect. In contrast to some other CLCs, there was no dependence of ClC-7 transport activity on intracellular ATP. In addition to the first biophysical characterization of ClC-7, which sparks ideas for follow up studies, the present work also extends the concept of voltage gating beyond ion channels to ion transporters.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-33858
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/3385
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3088
Exam Date: 28-Oct-2011
Issue Date: 18-Jan-2012
Date Available: 18-Jan-2012
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): CLC-Protein
Elektrophysiologie
Ionentransport
Struktur-Funktion-Studien
CLC protein
Electrophysiology
Ion transport
Structure-function studies
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