Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3099
Main Title: Establishment of an RNAi application platform in Mycobacterium tuberculosis infection models
Translated Title: Etablierung einer Plattform zur RNAi Anwendung in Mycobacterium tuberculosis Infektionsmodellen
Author(s): Jung, Ulrike
Advisor(s): Kaufmann, Stefan
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Ziel dieser Arbeit war es, eine Plattform zu entwicklen, mit deren Hilfe die Auswirkungen von Gen-Knockouts oder Gen-Knockdowns in M. tuberculosis Infektionsmodellen durch RNAi untersucht werden können. Die ursprünglich vorgeschlagene Methode, prokaryotische Zellen mit eukaryotischen Komponenten des RNAi Regulationsweges auszustatten und diesen so nachzubauen, mußte aufgegeben werden. Vorherige Ergebnisse über signifikante und zuverlässige Generierung von Gen-Knockdown und -Knockout ließen sich nicht reproduzieren. Stattdessen legen die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse nahe, daß zumindest in E. coli kein Argonaute 2 basierter RNAi Regulationsweg nachgebaut werden kann. Es bleibt weiter unklar, welcher Mechanismus zu den beobachteten Mutationen in M. smegmatis und L. monocytogenes in je einem Experiment geführt hat. Die Untersuchung des Hypothese, daß der zugrundeliegende Mechanismus die Aktivierung von FEN-1 wäre und nachfolgender fehlerhafter Doppelstrangbruch-Reparatur, konnte mit dem entwickelten Protokoll keine vergleichbaren Veränderungen auf genetischer Ebene erzeugen. Nichts desto trotz wurde aufgrund dieser Hypothese ein neues Protokoll entwickelt, welches in mehreren Experimenten zu erfolgversprechenden (wenn auch vorübergehenden) phäno- typischen Effekten führte. Der diesen zugrundeliegende Mechanismus ist noch nicht aufgeklärt. RNaseH Effekte konnten als einziger Wirkungsmechanismus ausgeschlossen werden, so daß transkriptionelle Inhibition des Zielgenes eine Rolle spielen könnte. Eine weitere Untersuchung dieses Protokoll, um den Wirkungsmechanismus zu verstehen, ist geplant. Die Anwendung von RNAi in eukaryotischen Zellen konnte durch die Kombination von zwei Komponenten erreicht werden. Die erste ist ein lentivirales Verpackungssystem, dessen seine Sicherheit in vitro und in vivo demonstriert worden ist. Die zweite Komponente ist eine Intron-Exon Expressionskassette für künstliche miRNAs. Da die überlegenen Eigenschaften von künstlicher miRNAs im Vergleich zu shRNAs bezüglich Zielspezifität der Effekte, Sicherheit in vivo und Vermeidung von Interferon I Antworten erwiesen sind, entspricht die entwickelte Plattform dem aktuellsten Forschungsstand und sollte kommerziell verfügbare Systeme übertreffen. Die Wirksamkeit des Systems in vitro in Infektionsmodellen wurde nachgewiesen, indem die Raf-1 vermittelte Expressionsregulation von PD-L1 über DC-SIGN in menschlichen primären DC nach Infektion mit BCG oder M. tuberculosis analysiert wurde. Der Knockdown der Expression zweier weiterer Gene in THP-1 Zellen auf unter 20% des Ursprungsniveaus konnte ebenfalls gezeigt werden. Die Kontrollkonstrukte ohne amiRNA oder mit einer amiRNA, welche gegen Luziferase gerichtet ist, funktionierten wie erwartet. Der Einfluß von Zielgen und amiRNA Sequenz auf die Knockdownstärke konnte für mehrere Gene und Konstrukte demonstriert werden. Der Vergleich zweier Raf-1 amiRNA Konstrukte (eins abgeleitet von einer funktionalen siRNA, eins aus Vorhersagen der Hannon-Elledge Datenbank) führte nur für das erste Konstrukt zu verlässlichem Knockdown auf mRNA und Protein-Ebene. Da unsere Ergebnisse eine effiziente Prozessierung der pre-miRNA unabhängig von deren doppelsträngigen Sequenz bestätigen, muß die Ursache dafür in der Aktivität der reifen amiRNA zu suchen sein. Zukünftige Experimente sollte daher die Regeln für optimale amiRNA Auswahl zum Thema haben, da dies der kritische Parameter einer erfolgreichen Anwendung ist. Zusätzliche Tests mit verschiedenen Promotoren, welche die Expression der amiRNA steuern, könnte die Knockdown Effizienz weiter erhöhen, wenn mögliche Abschalt-Effekte ("silencing") des CMVie Promoters so vermieden werden würden. Die Möglichkeit, endogene miRNAs mit Hilfe der entwickelten Plattform zu überexprimieren, wurde ebenfalls erfolgreich genutzt. Die Überexpression in verschiedenen Zelltypen scheint unterschiedliche Wirkungen auf das miRNA Expressionsmuster zu haben. Die Validierung vorhergesagter miRNA Zielgene war vergleichbar gut möglich wie nach Transfektion synthetisierter reifer miRNAs. Zusammenfassend scheint die entwickelte Plattform für beide Anwendungsgebiete gut geeignet zu sein.
Aim of this thesis was to develop a platform to research the impact of gene knockouts or knockdowns in M. tuberculosis infection models by RNAi. The proposed method about complementation of prokaryotic cells with eukaryotic RNAi components to mimic an RNAi like pathway of gene regulation had to be suspended. Previous results of significant and reliable generation of gene knockdown/knockout could not be reproduced. Results indicate that at least in E. coli Argonaute 2 based RNAi is not possible. It remains unclear what caused the mutations observed in M. smegmatis and L. monocytogenes in one experiment each. Verification of the hypothesis that an activation of FEN-1 with subsequent erratic DSB repair could be the underlying mechanism did not find similar changes on the genetic level with the current protocol. Nevertheless this hypothesis led to a new protocol which yielded promising transient phenotypic effects in several experiments. The underlying mechanism is so far not understood. While RNaseH effects could be ruled out as sole mechanism, inhibited transcriptional activity of the targeted gene could play a role. Further research on this protocol to understand the underlying mechanism and applicability in research is considered. The application of RNAi in eukaryotic cells could be achieved with the combination of two systems. The first is a lentiviral system which has shown its in vitro and in vivo safety. The second component is an intron-exon expression cassette for artificial miRNAs. Since the superior properties of artificial miRNAs compared to shRNAs in terms of target specificity of effects, safety in vivo and avoidance of IFN I response activation have been shown, the resulting platform is state of the art and should outperform commercially available systems. The efficacy of the system in vitro in infection models has been shown while analyzing the Raf-1 mediated regulation of PD-L1 by DC-SIGN in human primary DCs that were infected with BCG or M. tuberculosis. Knockdown of expression of two other genes in THP-1 cells below 20% could be achieved as well. Control constructs without miRNA or luciferase targeting miRNA performed as expected. The impact of target gene and amiRNA sequence on the knockdown level could be demonstrated for several genes and constructs. Comparison of two Raf-1 targeting artificial miRNAs with one derived from a validated siRNA and one predicted by the Hannon-Elledge database showed reliable knockdown on mRNA and protein level only for the first one. Since our results confirm published data about sequence independent processing efficacy of the pre-miRNA the reason for this is to search in the activity of the artificial mature miRNA. Further research needs to explore the optimal design rules for artificial miRNA as a critical parameter for the successful application of this platform. Additional tests with different promoters driving the expression of the artificial miRNA could improve the knockdown efficiency further and abrogate potential silencing of the CMVie promoter. The feasibility to overexpress endogenous miRNA with the developed platform could be shown as well. Overexpression of the same miRNA in different cell types seems to have different effects on the miRNA expression patterns. Predicted mRNA targets could be validated with similar results to transfection of synthesized mature miRNA. In conclusion the developed platform seems well usable for both applications.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-26409
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/3396
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3099
Exam Date: 15-Apr-2010
Issue Date: 31-Jan-2012
Date Available: 31-Jan-2012
DDC Class: 500 Naturwissenschaften und Mathematik
Subject(s): Lentivirus
Monozyten
RNAi
Tuberkulose
Lentivirus
MicroRNA
Monocytes
RNAi
Tuberculosis
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