Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3109
Main Title: Charakterisierungder Labyrinthopeptin-Synthetase LabKC in vitro
Translated Title: Characterization of the Labyrinthopeptin-Synthetase LabKC in vitro
Author(s): Müller, Wolfgang
Advisor(s): Süßmuth, Roderich
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Der erstmals 1988 beschriebene Actinomyceten-Stamm Actinomadura namibiensis produziert in seinem Kulturüberstand die drei Sekundärmetabolite LabA1, A2 und A3. Dabei handelt es sich um ribosomal synthetisierte Peptide, welche aufgrund ihrer posttranslational eingeführten Lanthionin-Verbrückungen in die Gruppe der Lantibiotika eingeordnet wurden. Die Aufklärung der Röntgenkristallstruktur von Labyrinthopeptin A2 erbrachte weitere detaillierte Einblicke in die bis dato noch relativ unbekannte Klasse III Lantibiotika. Eine zentrale Erkenntnis war vor allem die Entdeckung eines neuartigen Labionin-Motives. Mit der Identifizierung des Genclusters der Labyrinthopeptine wurde zudem der Grundstein für die weitere Untersuchung der Biosynthese gelegt. Neben den Sequenzen für die Vorläuferpeptide von LabA1 und LabA2 codieren weiterhin zwei Gene für den Export der Peptide, sowie ein Gen für ein Enzym LabKC, welches für die Einführung der Labionin-Verbrückungen verantwortlich ist. Durch Vergleich mit anderen bekannten Enzymen konnten in der Sequenz von LabKC eine N-terminale Lyase- und eine zentrale Ser/Thr-Kinase-Domäne sowie eine C-terminale Domäne mit Ähnlichkeit zu Lantibiotika-Zyklasen identifiziert werden. Der vorgeschlagene Mechanismus für die Labionin-Bildung sieht zunächst die Phosphorylierung von zwei Serin-Resten im LabA2 Präpropeptid vor, gefolgt von der anschließenden Zyklisierung über ein C-terminales Cystein durch eine doppelte Michael-Addition. Ausgehend von diesen Vorkenntnissen war das Hauptziel der vorliegenden Arbeit zunächst die Etablierung eines in vitro Enzym-Assays für die Untersuchung der Labyrinthopeptin-Biosynthese. Damit sollte eine detaillierte Charakterisierung der Funktionsweise des LabA2-prozessierenden Enzyms LabKC ermöglicht werden. Hierzu wurde dieses zunächst erfolgreich kloniert, in E. coli exprimiert und gereinigt. Die Bereitstellung geeigneter Peptidsubstrate für die enzymatische Umsetzung erfolgte mittels chemischer Peptidsynthese an fester Phase. Nach Optimierung der Assay-Bedingungen sowie unter Verwendung des Nukleotids GTP als Co-Substrat für die Phosphorylierungsreaktion konnte schließlich die komplette Dehydratisierung und Zyklisierung eines synthetischen LabA2-Präpropeptids erreicht werden. Für die Analytik der enzymatischen Umsetzungen wurden massenspektrometrische Methoden angewandt. Nach der Optimierung und Charakterisierung wichtiger Parameter für die in vitro Umsetzung mit LabKC stand die Untersuchung des katalytischen Mechanismus im Mittelpunkt der weiteren Arbeiten. Unter Anwendung von Mutagenese-Methoden konnten katalytisch wichtige Aminosäureseitenketten in der Lyase- und Ser/Thr-Kinase Domäne von LabKC identifiziert und ein entsprechender Mechanismus postuliert werden. Der Reaktionsablauf der Labyrinthopeptin-Biosynthese wurde zudem durch Umsetzungen synthetischer Labyrinthopeptin-Derivate mit LabKC untersucht. Ein weiteres Ziel war die detaillierte Untersuchung der Rolle des Leaderpeptids für die Biosynthese der Labyrinthopeptine. Im Rahmen dieser Arbeit konnte durch Testierung zahlreicher LabA2-Leaderpeptid-Varianten die absolute Notwendigkeit dieser Aminosäuresequenz für die erfolgreiche Prozessierung durch LabKC gezeigt werden. Weiterhin wurde ein Erkennungsmotiv identifiziert und charakterisiert. Im Fokus zukünftiger Arbeiten steht die Aufklärung des Mechanismus für die Labionin-Zyklisierung sowie die Strukturaufklärung von LabKC oder homologen Enzymen mittels Röntgenkristallographie.
The actinomycete Actinomadura namibiensis, which was firstly described in 1988, produces in its culture supernatant the three secondary metabolites LabA1, A2 and A3. These ribosomally synthesized peptides were classified as lantibiotics due to their posttranslationally introduced lanthionine bridges. Furthermore the successful elucidation of the crystal structure of Labyrinthopeptin A2 gave new insights in the so far unknown class III lantibiotics including the discovery of the novel Labionin motif. With the overall identification and sequencing of the Labyrinthopeptin gene cluster, further experiments yielded in the elucidation of the biosynthesis. The gene cluster consists of two structural genes coding for the precursor peptides of Labyrinthopeptin A1 andA2, two genes with sequence similarity to ATP dependent ABC transporters for the peptide export (labT1 and labT2), and one gene (labKC) coding for a putative modifying enzyme involved in the formation of the Labionin bridges. An N-terminal lyase, a central Ser/Thr Kinase domain as well as a C-terminal Domain with similarity to lantibiotics cyclases could be identified by sequence alignment with homologue enzymes. The proposed mechanism for formation of the labionin motif starts with the phosphorylation of two serine residues in the LabA2 prepropeptide, followed by a cyclization reaction including a C-terminal Cysteine residue by a twofold Michael-type addition. With this knowledge the first goal of the thesis was the establishment of an in vitro enzyme assay for the elucidation of the Labyrinthopeptin biosynthesis and the detailed enzymatic characterization of the LabKC enzyme. Therefore the coding sequence of LabKC was cloned in E. coli, expressed and further purified. The generation of suitable peptide substrates was accomplished by solid phase chemical synthesis. After further optimization of the assay conditions including GTP as co-substrate for the phosphorylation reaction, the complete dehydration and cyclisation of the LabA2 prepropeptide could be observed, by LC-ESI-MS methods. After optimization and characterization of the in vitro conditions, further work was focused on the evaluation of the catalytic mechanism. Usage of common mutagenesis techniques, succeeded in the identification of important catalytic amino acid side chains in the Lyase and Ser/Thr-Kinase domain. With these results a catalytic mechanism for LabKC was postulated. The catalytic reaction of the Labyrinthopeptin biosynthesis was further investigated by usage of synthetic Labyrinthopeptin derivatives. The investigation of the leader peptide in respect to the biosynthesis mechanism was a further goal in this work. By usage of numerous leader peptide variants, it could be shown that this sequence is obsolete for the successful processing by LabKC. Furthermore, a recognition motif in the leader peptide could be identified and further characterized. Future work will focus on the elucidation of the Labionin-cyclization reaction as well on the structure elucidation of LabKC or its homologues by X-ray crystallography.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-33259
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/3406
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3109
Exam Date: 29-Jul-2011
Issue Date: 7-Feb-2012
Date Available: 7-Feb-2012
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): In vitro assay
LabKC
Labyrinthopeptine
Lantibiotika
LC-MS
In vitro assay
LabKC
Labyrinthopeptins
Lantibiotics
LC-MS
Usage rights: Terms of German Copyright Law
Appears in Collections:Technische Universität Berlin » Fakultäten & Zentralinstitute » Fakultät 2 Mathematik und Naturwissenschaften » Institut für Chemie » Publications

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Dokument_27.pdf14,93 MBAdobe PDFThumbnail
View/Open


Items in DepositOnce are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.