Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3142
Main Title: Transcriptome analysis of Bmp4-induced mesoderm formation in vitro
Translated Title: Transkriptom Analyse von Bmp4 induziertem, in vitro gebildetem Mesoderm
Author(s): Shin, Eun-ha
Advisor(s): Herrmann, Bernhard
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Gastrulation ist ein fundamentaler Prozess während der Embryogenese von Säugetieren, der die drei primären Keimblätter Ektoderm, Mesoderm und Endoderm generiert. In dieser Arbeit wurde die Bildung von Mesoderm auf Ebene des Transkriptoms analysiert. Hierfür wurde eine embryonale Stammzelllinie hergestellt, die über Regulation des Brachyury (T) Promoters einen mCherry Reporter exprimiert. T ist ein Transkriptionsfaktor der T-box Familie und Expression von T markiert mesodermale Zellen. mCherry kodiert für ein rot fluoreszierendes Protein; hiermit wird die Isolierung von mesodermalen Zellen über Durchflusszytometrie ermöglicht. Durch die in vitro Differenzierung dieser Stammzelllinie mit rekombinantem Bmp4 konnten konsekutive Entwicklungsschritte während der Entstehung des mesodermalen Keimblattes identifiziert werden: zunächst nehmen die Zellen ein Epiblast- zu Mesendoderm-ähnlichen Stadium an, bevor laterales Mesoderm gebildet wurde. Parallel zur Entstehung der mesendodermalen Zellen konnte eine Phase während der Differenzierung beobachtet werden, in der Gene aktiviert wurden, die charakteristisch für Migration, Proliferation und Biosynthese von Cholesterol und Lipiden sind. Im Lauf der in vitro Kultur konnte eine Zunahme von Bmp1 and Bmp7 Transkripten identifiziert werden, während Fgf5 und Fgf8 ein dynamisches Expressionsprofil aufwiesen. Diese Wachstumsfaktoren aktivieren Signalwege, die essentiell für die Mesodermbildung sind. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass Veränderung in der Expression dieser Liganden von spezifischen epigenetischen Modifizierungen begleitet werden. Zusammenfassend haben diese Daten ergeben, dass die Differenzierung von embryonalen Stammzellen mit Bmp4 in vitro ein komplexes Signalnetzwerk aktiviert, das zelluläre und molekulare Prozesse induziert, die die Entwicklung der Zellen in Richtung des lateralen Mesoderms lenken. Zusätzlich zur Analyse von fortlaufenden Differenzierungsstadien des mesodermalen Keimblatts, wurde die Mesodermbildung bei reduzierter Expression von T untersucht. Die T-mCherry Reporter Stammzelllinie wurde genetisch derart modifiziert, dass sie ein Doxyzyklin induzierbares, miRNA basiertes “knockdown” System gegen das T-Transkript beinhaltet. Mausembryonen, die Mutationen im T Lokus aufweisen, zeigen aufgrund von Defekten in der Mesodermentstehung schwerwiegende Missbildungen entlang der posterioren Achse und sterben bereits am elften Tag der Embyonalentwicklung. Mausembryonen, die aus den T “knockdown” Stammzellen generiert wurden, zeigen diesen T Funktionsverlust-Phänotyp, wenn durchgehend die Expression der T-miRNA induziert wurde. Die Aktivierung des T “knockdown” während der in vitro Differenzierung mit Bmp4, ermöglichte eine molekulare Analyse über die Funktion von T während der Mesodermbildung. Hiermit konnte gezeigt werden, dass insbesondere Gene dereguliert waren, die an der Entstehung von Herz- und hämatopoetischem Mesoderm beteiligt sind. In der Anwesenheit von T, spezifizierten die Zellen bevorzugt in Herzzellen, während in der Abwesenheit von T eine hämatopoetische Entwicklung initiiert wurde. Transkription von Genen, die mit der Bildung von Blutgefäßen assoziiert sind, wurden in beiden Zellpopulationen gefunden. Desweiteren hat eine Untersuchung von wichtigen entwicklungsspezifischen Signalwegen ergeben, dass Bmp7 in den T “knockdown” Zellen leicht hochreguliert ist, wohingegen die Expression of Fgf5 mRNA geringer war als in den normal differenzierten Zellen. Eine erhöhte Expression von Aktinen und Genen der epithelial-zu-mesenchymalen Transition wurde gezeigt, wenn T während der in vitro Differenzierung exprimiert wurde. Im Gegensatz dazu konnte eine Expression dieser Gene nicht detektiert werden, wenn T “knockdown” induziert wurde. Zusammengefasst legt diese Analyse nahe, dass T für die Dynamik von Aktin Molekülen und für die Adaption von mesenchymalen Zellmerkmalen notwendig ist.
During mammalian embryogenesis, gastrulation is a fundamental process that generates the three primary germ layers ectoderm, mesoderm, and endoderm. In this study, the establishment of the mesodermal lineage was analyzed on a transcriptome-level. For this purpose, an embryonic stem cell (ESC) line was generated with expression of a mCherry reporter under the control of the Brachyury (T) promoter. T is a T-box transcription factor and its expression marks all cells that are fated to become mesoderm. mCherry codes for a red fluorescent protein, allowing distinct isolation of mesodermal cell populations via fluorescence-activated cell sorting. By differentiating these reporter ESCs with recombinant Bmp4 in vitro, progressive steps during the development of the mesodermal germ layer could be identified, passing from an epiblast- to mesendodermal-like state before lateral mesoderm was formed. Concomitant with the generation of mesendodermal cells, temporal expression of genes involved in cell migration, proliferation, as well as genes contributing to the biosynthesis of cholesterol and lipids was detected. During the in vitro differentiation timecourse, an upregulation of Bmp1 and Bmp7 transcripts was identified, while Fgf5 and Fgf8 displayed a dynamic expression profile. These growth factors activate signaling pathways that are known to be important for mesoderm formation. Furthermore, transcriptional changes of these ligands were shown to be paralled by histone modifications. Together these findings revealed that Bmp4-driven ESC differentiation in vitro activates a complex signaling network to induce cellular and molecular events that direct development towards the generation of lateral mesoderm. In addition to dissecting consecutive differentiation steps during specification of the mesodermal germ layer, mesoderm formation under conditions of reduced T were also elucidated. The T-mCherry reporter ESCs were genetically engineered to contain a doxycycline inducible T RNA interference system. Murine embryos homozygous null for T display severe malformations along the posterior axis, due to defects in mesoderm formation and die at 11 days post coitum. When T knockdown is induced throughout murine development, ESC-derived embryos phenocopied the T loss of function phenotype. Induction of T knockdown during Bmp4 differentiation in vitro allowed the molecular dissection of T function during mesoderm development. In particular, genes involved in cardiac mesoderm and hematopoetic development were shown to be affected. In the presence of T, specification towards the cardiac lineage appears to be favored, while in the absence of T, specification into the hematopoetic lineage seems to be initiated. Genes associated with vasculogenesis were transcribed in both populations. Furthermore, investigation of important developmental signaling pathways unveiled that Bmp7 is slightly upregulated in the T knockdown population, while Fgf5 mRNA levels are lower than in wildtype counterparts. In the presence of T, actins and epithelial-to-mesenchymal transition genes displayed increased transcription over the in vitro differentiation course, while in the absence of T, expression of these genes could not be detected. Jointly, this analysis suggests that T is necessary for actin dynamics and adaption of mesenchymal cell traits.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-34301
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/3439
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3142
Exam Date: 12-Dec-2011
Issue Date: 7-Mar-2012
Date Available: 7-Mar-2012
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): Bmp4
Brachyury
In vitro Differenzierung
Mesoderm
Bmp4
Brachyury
In vitro differentiation
Mesoderm
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