Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3143
Main Title: Characterization of methanogenic Archaea communities in biogas reactors by quantitative PCR
Translated Title: Charakterisierung der methanogenen Archaea Lebensgemeinschaft in Biogasreaktoren mit Hilfe der quantitativen PCR
Author(s): Bergmann, Ingo
Advisor(s): Szewzyk, Ulrich
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Die Energiegewinnung aus nachwachsenden Rohstoffen gewinnt zunehmend an Bedeutung. Zu einer der wichtigsten erneuerbaren Energiequellen zählt das Biogas. Neben der technischen Optimierung von Biogasreaktoren und –anlagen sind detaillierte Kenntnisse über die Diversität und die Zusammensetzung der mikrobiellen Lebensgemeinschaft unabdingbar, um den Biogasbildungsprozess zu optimieren. Das Ziel dieser Arbeit war eine hoch sensitive und kultivierungsunabhängige Methode für die Detektion und Quantifizierung von methanogenen Archaea in Biogasanlagen zu etablieren. Als Nachweismethode diente die quantitative real- time PCR (Q-PCR). Nach der Etablierung der optimalen DNA-Extraktionsmethode wurden Primer Sets, basierend auf der Grundlage des 16S rRNA Gens, welche durch Yu et al. (2005a) entwickelt wurden, optimiert. Nach der Adaptation der PCR Protokolle an das ABI System konnte diese molekulargenetische Methode zur Quantifizierung der methanogenen Archaea in Biogasreaktoren genutzt werden. Unter mesophilen Bedingungen konnte eine große Variabilität innerhalb der Zusammensetzung der methanogenen Archaea festgestellt werden. In klassischen Rührkesselreaktoren dominierten, in Abhängigkeit vom eingesetzten Substrat, sowohl die hydrogenotrophen als auch die acetotrophen Methanbildner. In mesophil betriebenen Biogasanlagen waren hingegen immer die hydrogenotrophen methanogenen Archaea der Ordnungen Methanomicrobiales und Methanobacteriales vorherrschend. Unter thermophilen Bedingungen konnte ebenfalls ausschließlich eine Dominanz an Vertretern der hydrogenotrophen Methanbildner festgestellt werden. Im Verlauf einer Belastungssteigerung eines mesophilen Rührkesselreaktors konnte eine Verschiebung der acetotrophen methanogenen Lebensgemeinschaft zu einer hydrogenotroph dominierenden beobachtet werden. Als biologischer Marker für eine beginnende Prozessinstabilität kann die Gruppe der Methanosaetaceae angesehen werden. Neben dem 16S rRNA Gen wurde als zweites Zielgen für die Q-PCR das reguliert exprimierte Methyl-Coenzym M Reduktase Untereinheit α Gen (mcrA Gen) verwendet. Es wurden Primer Sets für Vertreter der Methanomicrobiales, Methanobacteriales, Methanosarcinaceae and Methanosaetaceae entwickelt und auf ihre Anwendbarkeit überprüft. Eine erfolgreiche Etablierung konnte für die Primer Sets, welche auf Familienebene abgeleitet wurden, erreicht werden. Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Q-PCR eine akkurate und zeitsparende Methode ist, um methanogene Archaea in Reaktorsystemen nachzuweisen. Zudem legt sie den Grundstein für Stoffwechselaktivitätsanalysen auf der Grundlage der RNA-Analytik durch den kombinierten Einsatz des mcrA und des 16S rRNA Gen Nachweisassays.
Energy production from renewable raw material is of increasing importance. Biogas is one of the major renewable energy sources ensuring an adequate energy supply for the next generations. Beside technical optimization and upgrading of biogas reactors and plants, detailed information about the diversity and composition of the participating microbial community structure is indispensable for optimizing the biogas-forming process. The main objective of this study was the establishment of a highly sensitive and culture independent approach for the detection and quantification of methanogenic Archaea in biogas reactors and plants at the taxonomic level of orders and families. The method of choice was the quantitative real-time PCR (Q-PCR). After finding the most efficient DNA extraction protocol, primer sets which were developed for the detection of the 16S rRNA gene by Yu et al. (2005a) were optimized. Subsequently, this molecular genetic approach was used for the analysis of the quantitative distribution of methanogenic Archaea in biogas fermenters and plants. A great variability in the composition of the methanogenes was observed at mesophilic conditions. Depending on the chosen substrate hydrogenotrophic or acetotrophic methanogenes were most abundant in laboratory CSTRs. By contrast, the hydrogenotrophic Methanomicrobiales and Methanobacteriales were always the dominant methanogenes in samples taken from mesophilic working agricultural biogas plants. At thermophilic conditions the hydrogenotrophic methanogenes always represented the process dominating group. By analyzing the methanogenic community structure during the continuous increase of the organic loading rate (OLR) at mesophilic conditions, a shift from an acetotrophic to a hydrogenotrophic dominated population structure was observed. Methanosaetaceae might be taken as a biological indicator for early process instability because of the sudden vanishing of this methanogenic group by increasing propionic and acetic acid concentrations. Beside the 16S rRNA gene, the facultative expressed methyl-coenzyme M reductase subunit α gene (mcrA gene) was chosen as target gene for Q PCR analysis. Primer sets were derived for Methanomicrobiales, Methanobacteriales, Methanosarcinaceae and Methanosaetaceae. Afterwards, the developed primer sets were tested for their suitability of quantifying methanogens in biogas reactor samples. At the phylogenetic level of families an establishment of specific primer sets became feasible. The results of this study prove the importance of Q-PCR as an accurate and time saving molecular genetic approach for determining abundancies of methanogenic Archaea in biogas reactor samples. This work is an indispensable pre-requisite for metabolic activity measurements of methanogenes by combining the Q-PCR assays of the mcrA and the 16S rRNA gene for RNA analysis.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-34367
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/3440
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3143
Exam Date: 19-Sep-2011
Issue Date: 7-Mar-2012
Date Available: 7-Mar-2012
DDC Class: 500 Naturwissenschaften und Mathematik
Subject(s): Biogas
Biogasreaktoren
Methanogene
Q-PCR
Biogas
Biogas reactors
Methanogenes
Q-PCR
Usage rights: Terms of German Copyright Law
Appears in Collections:Technische Universität Berlin » Fakultäten & Zentralinstitute » Fakultät 3 Prozesswissenschaften » Institut für Technischen Umweltschutz » Publications

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Dokument_9.pdf2.34 MBAdobe PDFThumbnail
View/Open


Items in DepositOnce are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.