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Main Title: Massenspektrometrische Identifizierung posttranslationaler Modifizierungen mit monomerem N-Acetylglukosamin an Proteasomen
Translated Title: Identification of posttranlational modifications with monomeric N-Acetylglucosamine on proteasomes by mass spectrometry
Author(s): Overath, Thorsten
Advisor(s): Lauster, Roland
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Das Proteasom ist ein abundanter proteolytischer Komplex. Es degradiert ATP-abhängig poly-ubiquitinierte Substrat-Proteine und nimmt eine wichtige Rolle im Zellzyklus und der Zell-vermittelten Immunität ein. Der Komplex, welcher die selektive Proteolyse ermöglicht, ist das 26S-Proteasom. Es setzt sich aus dem proteolytisch aktiven 20S-Kern und ein oder zwei 19S-Regulatoren zusammen. In Westernblot-Experimenten konnte gezeigt werden, dass 20S- und 26S-Proteasomen von der Fruchtfliege bis zum Menschen mit monomerem N-Acetylglukosamin (O GlcNAc), eine Serin/Threonin-Modifizierung ähnlich der Phosphorylierung, markiert werden können. Es existieren Beispiele für antagonistische und synergistische Kreuz-Kommunikationen zwischen diesen beiden Modifizierungen. Im Gegensatz zu poly N- und O-Glykosylierungen handelt es sich bei O GlcNAc um eine substöchiometrische, reversible und dynamische Modifizierung zytosolischer und nukleärer Proteine. Ihr werden wichtige Rollen in Signaltransduktionswegen und der Entwicklung von chronischen Krankheiten wie Diabetes mellitus, Alzheimer und Krebs zugeschrieben. Die exakten Positionen und der Einfluss dieser Zucker-Modifizierung auf Proteasomen sind größtenteils unbekannt. In dieser Arbeit wird eine -Eliminierung/Michael Addition-basierte quantitative Derivatisierungsstrategie mit einem neuen nukleophilen Reagenz, bestehend aus einem Biotin- und einem Cystamin-Rest, vorgestellt. Durch die eingeführte Markierung ist es nicht nur möglich substöchiometrisch O GlcNAc-modifizierte Proteine/Peptide effektiv affinitätschromatographisch anzureichern, die eingeführte Markierung ist darüber hinaus, im Gegensatz zu O GlcNAc selbst, unter massenspektrometrischen stoßaktivierten Zerfallsbedingungen stabil, was eine exakte Identifizierung der O GlcNAc-Modifizierungsposition ermöglicht. Während der Fragmentierung erzeugt die Markierung Indikator-Ionen, welche ein automatisches Durchsuchen von großen MS-Datensätzen nach potentiell O GlcNAc-modifizierten Kandidaten erlaubt. Aufgrund bekannter  Eliminierung/Michael Addition-assoziierter Nebenreaktionen, wie dem unspezifischen Umsatz unmodifizierter Serin/Threonin-Reste, wurde ein strukturell identischer aber vier Dalton schwererer, stabil deuterierter Biotin-Cystamin-Rest synthetisiert. Dieser erlaubt eine relative Quantifizierung zwischen deglykosylierter und glykosylierter Probe innerhalb eines MS-Spektrums. Mit dieser Methode war es möglich, eine bekannte und sieben vorher unbekannte O GlcNAc-Modifizierungen an murinen Milz- und Gehirn-20S-Proteasomen sowie zwei unbekannte an murinem Leber-HSP90 zu identifizieren. Die O GlcNAc-Position an Ser452 von HSP90 ist eine bekannte Phosphorylierungsstelle, was auf einen antagonistischen Zusammenhang zwischen diesen beiden Modifizierungen hinweist. Im Rahmen dieser Arbeit wurde deutlich, dass aufgrund der hohen Gewebe-abhängigen Diversität der 20S-Proteasom-Komplexe, ungewöhnlich große Mengen an aufgereinigten Protein für den O-GlcNAc-Nachweis eingesetzt werden mussten. Die hier präsentierten Ergebnisse eröffnen neue Perspektiven für nachfolgende Untersuchungen über den Einfluss dieser abundanten, regulatorischen posttranslationalen Modifizierung
The proteasome is an abundant proteolytic complex. It degrades poly-ubiquitinated substrates in an ATP-dependent manner and plays a crucial role in cell cycle and cell derived immunity. The complex which is responsible for this selective proteolysis is called 26S-proteasome. It consists of a 20S catalytical core complex and one or two 19S regulatory complexes. Westernblot-experiments showed that 20S- and 26S-proteasomes from fruit fly to man are extensively modified by monomeric -O linked N-acetylglucosamine (O-GlcNAc), which similar to phosphate can be found on serine/threonine-residues. There are examples of extensive antagonistic and synergistic cross talk between these two modifications. In contrast to poly N- and O-glycosylations O-GlcNAc is a substochiometric, reversible and dynamic cytosolic and nuclear modification. It has been shown that O GlcNAc takes part in cell signaling events and in development of chronic diseases such as Diabetes mellitus, Alzheimer´s disease and cancer. The exact sites and the impact of this sugar modification on proteasomes are largely unknown. Here we describe a -elimination/michael addition based quantitative derivatisation strategy with a new nucleophilic tag consisting of a biotin- and a cystamine-moiety. This tag not only allows an efficient affinity purification of substochiometric O GlcNAc-modified proteins/peptides but, in contrast to O GlcNAc itself, it is also stable under mass spectrometry collision induced fragmentation conditions allowing the exact identification of the modified serine/threonine residue. During fragmentation the tag produces abundant indicator ions, facilitating the screening of huge MS data sets for potentially O GlcNAc-modified candidates. Due to the known -elimination/michael addition-associated side reactions, like unspecific derivatisation of unglycosylated serine/threonine-residues, we synthesized a structural identical but four dalton heavier stable deuterated biotin-cystamine-tag which allows relative quantification between a deglycosylated and glycosylated sample in one MS-spectrum. With this application we were able to identify one known and seven formally unknown O GlcNAc-sites on 20S-proteasomes isolated from mouse spleen and brain and two unknown O GlcNAc-sites on HSP90 from mouse liver. The O GlcNAc-site on Ser452 of HSP90 is also a known phosphorylation-site indicating an antagonistic relationship between these two modifications. In the course of this work we noticed that due to the vast tissue-dependent diversity of the 20S-proteasome complexes, it was necessary to use unusual huge amounts of isolated protein for the O-GlcNAc-detection. These findings open new perspectives for further investigations concerning the impact of this abundant and crucial regulatory posttranslational modification.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-29000
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/3454
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3157
Exam Date: 1-Dec-2010
Issue Date: 21-Mar-2012
Date Available: 21-Mar-2012
DDC Class: 620 Ingenieurwissenschaften und zugeordnete Tätigkeiten
Subject(s): HSP90
Massenspektrometrie
N-Acetylglukosamin
Phosphorylierung
Proteasom
HSP90
Mass spectrometry
N-Acetylglucosamine
Phosphorylation
Proteasome
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