Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3262
Main Title: Etablierung ultrasensitiver generischer Nukleinsäuretestverfahren zum Nachweis hochpathogener Mikroorganismen
Translated Title: Establishment of ultra-sensitive generic nucleic acid-based methods for the detection of highly pathogenic microorganisms
Author(s): Schröder, Kati
Advisor(s): Lauster, Roland
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: In der Diagnostik und Detektion von hochpathogenen Mikroorganismen bilden molekularbiologische, nukleinsäurebasierte Methoden, wie die (real-time) PCR eine tragende Säule. In dieser Arbeit wurden sowohl die Aufbereitung von Erreger-Nukleinsäuren aus Umweltproben, als auch die eigentliche Nukleinsäure- Detektion optimiert. So wurde ein Verfahren entwickelt, mit dem mögliche PCR-Inhibitoren vor der Extraktion von DNA und RNA erfolgreich aus diversen Umweltsubstanzen entfernt werden konnten. Die anschließende Detektion der isolierten Erreger- Nukleinsäuren wurde vor allem in Hinblick auf Schnelligkeit, Zuverlässigkeit und Spezifität optimiert. Durch die, im Rahmen dieser Arbeit erfolgte, Entwicklung eines Screening Verfahrens, welches die real-time PCR mit der Pyrosequenzierung (PSQ) kombiniert, können Erreger-Nukleinsäuren schnell und sehr spezifisch nachgewiesen und die detektierten Pathogene durch die anschließende Sequenzierung typisiert werden. Um Probenmaterial und Reagenzien, sowie Zeit und Kosten zu sparen, wurden verschiedene multiplex real-time PCR Systeme entwickelt. Zum einen wurde eine 5-plex real-time PCR etabliert, mit der weniger als 40 Genomäquivalente von vier bioterroristisch relevanten hochpathogenen Erregern detektiert werden können. Zum anderen wurde die multicolour multiplex PCR am Beispiel der Diagnostik von Pockenvirusinfektionen entwickelt. Diese ermöglicht die Differenzierung von Ortho- (OPV), Para- und Molluscipockenviren, der drei wichtigsten Genera, die humanpathogene Vertreter der Pockenviren enthalten. Die weitere Identifizierung und Typisierung von OPV wird durch die, in dieser Arbeit, etablierte multiplex PSQ ermöglicht. Jede OPV Spezies erzeugt dabei ein spezifisches Sequenzmuster und kann damit in weniger als einer Stunde nach der PCR Reaktion identifiziert werden. Für die ungerichtete Suche nach Infektionserregern in klinischen Proben, wurde ein Protokoll entwickelt, mit dem die Aufbereitung von Nukleinsäuren aus humanem Gewebe in Vorbereitung auf das Next Generation Sequencing ermöglicht wird. Nach Entfernung humaner Hintergrund- rRNA findet die Sequenzierung aller Nukleinsäuren einer Probe mit der 454-Technologie statt. Mit diesem Verfahren wurde nach einer infektiösen Ursache des plötzlichen Kindstods gesucht. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit verschiedene innovative Verfahren der nukleinsäurebasierten Detektion von hochpathogenen Erregern erfolgreich etabliert und optimiert, die das Methodenspektrum der bisherigen molekularbiologischen Diagnostik erweitern und ergänzen können.
Today, molecular diagnostics and detection of highly pathogenic agents rely to a great extent on nucleic acid-based methods, especially on real-time PCR. In this thesis, the preparation of nucleic acids of pathogens from environmental samples as well as the detection of nucleic acids could be optimized. A preparation method could be established to diminish PCR-inhibitory substances from diverse environmental samples prior to extraction of DNA and RNA. The subsequent detection of the extracted nucleic acids was optimized concerning speed, reliability and specificity. As a screening method, a combination of real-time PCR and pyrosequencing was established allowing the fast and very specific detection of nucleic acids and typing of detected pathogens by the subsequent sequencing. In order to save sample material and reagents and to reduce process time and costs, different multiplex real-time PCR formats were developed. On the one hand, a 5-plex real-time PCR assay was established, that allows sensitive detection of less than 40 genome equivalents of four highly pathogenic biothreat agents in parallel. On the other hand, a multicolour, multiplex (mm) PCR was developed using the example of poxvirus diagnostics. This mmPCR assay allows the fast and specific differentiation of ortho- (OPV), para- and molluscipoxviruses, which are the three most important genera containing human pathogenic poxviruses. In addition, OPV can be identified and typed by the multiplex pyrosequencing assay that has been developed in the course of this project. In doing so, a specific fingerprint is generated for each OPV species, enabling the identification in less than one hour after the PCR reaction. Beyond that, an optimized protocol has been developed for the preparation of nucleic acids from human specimens in order to search for infectious agents in clinical samples by an unbiased next generation sequencing approach. This protocol includes an additional step to remove human rRNA from the sample and subsequent sequencing of all remaining nucleic acids in the sample by 454-sequencing. This approach was then applied for the search of an infectious cause of sudden infant death syndrome. In conclusion, different innovative methods of nucleic acid based detection of highly pathogenic agents have been successfully established and optimized. These novel detection methods can broaden and complement current systems of molecular diagnostics.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-35895
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/3559
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3262
Exam Date: 22-Jun-2012
Issue Date: 28-Jun-2012
Date Available: 28-Jun-2012
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): Detektion
Hochpathogen
Mikroorganismen
Nukleinsäure
Sequenzierung
Detection
Highly pathogenic
Microorganisms
Nucleic acid
Sequencing
Creative Commons License: https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/2.0/
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