Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3290
Main Title: Structural and Functional Investigations on the Photosystem II core subunit PsbO and the antenna pigment-protein complex CP29
Translated Title: Strukturelle und funktionelle Untersuchungen an der Kernuntereinheit PsbO des Photosystems II und dem Antennen-Pigment-Protein-Komplex CP29
Author(s): Slowik, Daria Marta
Advisor(s): Saenger, Wolfram
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Im Hinblick auf eine Qualitätskontrolle für zukünftige Studien zum PSII (z.B. artifizielle Photosynthese) wurden verschiedene Untersuchungen zu den Proteinen PsbO und CP29 durchgeführt. Zusätzlich zu einem neuen Protokoll für das Refolding des in E. coli exprimierten PsbO aus Spinat wurde für das PsbO-Protein aus Cyanobakterien und Pflanzen ein robustes rekombinantes Expressionssystem, basierend auf Fusionsproteinen, zur Produktion von löslichem PsbO für strukturelle und funktionelle Analysen in Lösung entwickelt. Beide Fusionsproteine bestehen aus dem Maltose-Bindeprotein (MBP) von E. coli und dem PsbO des Photosystems II (PSII), das entweder aus Spinat (MBP-S) oder von Thermosynechococcus elongatus (MBP-T) stammt. Die Proteine wurden mittels biochemischer (Immunoblot, Rekonstitutionsexperimente, Aktivitätstests) und biophysikalischer (SAXS, UV-CD, MALDI-TOF-MS) Methoden charakterisiert. Diese Studie präsentiert die bis dato längsten publizierten Fusionsproteine, die in Abwesenheit extrinsischer Untereinheiten an PSII-Membranfragmente binden, wodurch sich ein quasi-natives PSII mit ähnlichen oder sogar höheren Sauerstofffreisetzungsraten als Wildtyp-PsbO rekonstituieren lässt. Die spezifische Bindung an PSII wurde mittels MALDI-TOF-MS gezeigt. Die Insertion einer AcTEV®-Spaltstelle innerhalb des MBP-S ermöglicht die Produktion von löslichem PsbO (Spinat) in E. coli, welches sich bei Expression in seiner nativen Form hauptsächlich in den Einschlusskörpern anreichert. Zudem wird die niedrig aufgelöste Struktur des Wildtyp-PsbO aus Spinat und die des Fusionsproteins in Lösung, erhalten mittels Kleinwinkelröntgenstreuung (SAXS), präsentiert. Des Weiteren wird die durch „Ab initio“- und „Rigid body“-Berechnungen erhaltene molekulare Hülle beider Proteine gezeigt. Es werden Daten präsentiert, die zeigen, dass PsbO als Fusionsprotein sein charakteristisches reversibles thermales Entfalten verliert, wobei die kovalente Bindung des Fusionspartners weder dessen Gesamtgröße noch -form verändert. Das computergestützte Modell für PsbO aus Pflanzen wurde experimentel mittels SAXS validiert und wird in Bezug auf Röntgenstrukturdaten von PSII-assoziierten PsbO aus Cyanobakterien [1] sowie theoretischen Daten für PSII aus Pflanzen [2] diskutiert. Hieraus wird geschlussfolgert, dass PsbO aus Pflanzen und aus Cyanobakterien ähnliche 3D-Strukturen aufweisen. In Übereinstimmung mit strukturellen Daten für PsbO aus Cyanobakterien liegt PsbO aus Spinat allein und als Fusionsprotein in Lösung als Monomer vor. Das aus SAXS-Untersuchungen erhaltene Modell für MBP-S wurde auf die hochaufgelöste Kristallstruktur des PSII aus Cyanobakterien [1] und einem theoretischen Modell des PSII aus Pflanzen [2] übertragen. Es wurde geschlussfolgert, dass beide Fusionsproteine aus zwei unabhängigen Domänen bestehen. Im Modell befindet sich die MBP-Domäne nahe den Positionen von beispielsweise anderen extrinsischen Untereinheiten innerhalb des PSII. Da die MBP-Domäne in enger Verbindung mit dem CP43 Protein gefunden wurde, ist es möglich, dass sie die Rolle des abwesenden PsbP Proteins übernimmt. Die erhaltenen Daten unterstützen das Modell von [3], dass in vivo Protein-Protein-Interaktionen an der Aktivierung der Kalziumbindungsfähigkeit von PsbO durch dessen Überführung in den aktiven Konformationszustand beteiligt sind. Es wird vorgeschlagen, dass der für das PSII in Cyanobakterien postulierte Mechanismus für den Zugang des Wassers zum aktiven Zentrum, der Proteininteraktionen von PsbO mit beispielsweise einer oder mehrerer extrinsischer Untereinheiten umfasst, ebenso im PSII der Pflanzen vorhanden ist. Die molekularen Mechanismen in Reaktion auf Licht-Stress wurden mittels Identifizierung und vorläufiger Charakterisierung eines neuen Lhcb4.x Proteins aus Spinat untersucht. Analog zu PsbO2 und Lhcb4.3 aus Arabidopsis th., wird auch Lhcb4.x in Reaktion auf starke Lichteinstrahlung exprimiert. Es wird postuliert, dass Lhcb4.x eine Komponente des natürlichen Schutzmechanismus gegen Umweltbedingungen mit hoher Lichteinstrahlung ist. Die partielle Proteinsequenz wurde von der cDNA-Sequenz abgeleitet. Das Protein ist phosphoryliert (wahrscheinlich am konservierten Thr83). Des Weiteren wird postuliert, dass es sich bei Lhcb4.x um das Analog von Lhcb4.3 aus Arabidopsis th. handelt.
Investigations on PsbO and CP29 proteins of PSII were done with respect to quality control of PSII for future study, e.g. for artificial photosynthesis. In addition to a new refolding protocol established for spinach PsbO expressed in E. coli, a robust recombinant expression system to produce soluble PsbO suitable for structural/ functional analyses in solution was developed for cyanobacteria and plant PsbO, using a fusion protein approach. Both fusion proteins are composed of maltose binding protein (MBP) from E. coli and PsbO of photosystem II (PSII), either from spinach (MBP-S) or from Thermosynechococcus elongatus (MBP-T). Proteins were characterized by biochemical (immunoblot, reconstitution experiment, activity test) and biophysical (SAXS, UV-CD, MALDI-TOF-MS) methods. This study presents the largest fusion proteins reported so far which bind to PSII membrane fragments depleted of extrinsic subunits and reconstitute a quasi-native PSII at similar or even higher oxygen evolving rates than wild-type PsbO. The specific binding to PSII was confirmed by MALDI-TOF-MS. Insertion of the AcTEV®-cleavage site within MBP-S enabled to obtain soluble spinach PsbO from E. coli, which, when expressed in its native form, mainly accumulates in inclusion bodies. The low resolution structure of wild-type spinach PsbO and that of fusion protein in solution derived from small-angle X-ray scattering (SAXS) analysis is presented. The molecular envelope of both proteins obtained by ab initio and by rigid body refinement is shown. It is shown that PsbO loses its characteristic reversible thermal unfolding when it occurs as fusion protein, but its overall size/ shape does not change when the fusion partner is covalently linked. The computer-designed model for plant PsbO was experimentally validated by SAXS and is discussed with respect to X-ray data for PSII-associated cyanobacterial PsbO [1] and with respect to that of theoretically concluded plant PSII [2]. It is concluded that plant and cyanobacterial PsbO have similar 3D structures. In agreement with structural data on cyanobacterial PsbO, spinach PsbO alone and as fusion protein is a monomer in solution. The obtained model of MBP-S derived from SAXS was assigned to the high-resolution crystal structure [1] of cyanobacterial PSII and to a theoretical model of PSII predicted for higher plants [2] as well. It was concluded that both fusion proteins are composed of two independent domains. The MBP domain was modeled to be located close to but not at the same positions like other extrinsic subunits within PSII. It might be that it compensates the role of depleted PsbP protein, as it was found in close relation to the CP43 protein. The obtained data support the model reported by [3] that in vivo protein-protein interactions can play a role in activating PsbO for calcium binding by converting it to an active conformation state. It is suggested that the mechanism of water access to the active center of PSII, involving protein interactions of PsbO e.g. with extrinsic subunit(s), proposed for cyanobaterial PSII, occurs also within plant PSII. The molecular mechanism of the response of PSII to light-stress was investigated via identification and preliminary characterization of a new Lhcb4.x protein in spinach. Analogously to PsbO2 and Lhcb4.3 in Arabidopsis th., Lhcb4.x is expressed in response to high light conditions, and it is proposed to be one of the constituents of the natural protective mechanism against high light stress environmental conditions. The partial protein sequence was deduced on the basis of cDNA. The protein is phosphorylated, possibly at conserved Thr83. Lhcb4.x is proposed to be the analogue of Lhcb4.3 from Arabidopsis th.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-36035
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/3587
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3290
Exam Date: 25-Apr-2012
Issue Date: 27-Jul-2012
Date Available: 27-Jul-2012
DDC Class: 500 Naturwissenschaften und Mathematik
Subject(s): CP29
Fusionsprotein
Photosystem II
PsbO
SAXS
CP29
Fusion protein
Photosystem II
PsbO
SAXS
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