Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3455
Main Title: Expansion of embryonic stem cells in 3D-bioreactors
Translated Title: Expansion embryonaler Stammzellen in 3D-Bioreaktoren
Author(s): Knöspel, Fanny
Advisor(s): Lauster, Roland
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Humane pluripotente Stammzellen (hPSC) stellen eine viel versprechende Quelle für klinische und wissenschaftliche Anwendungen im Bereich der regenerativen Medizin dar. Hinsichtlich dieser möglichen Anwendungen ist die Produktion von ausreichend großen Zellmengen eine große Herausforderung an die Forscher. Da das Verhalten von pluripotenten Stammzellen in in vitro-Kulturen stark von den Kulturbedingungen wie Umgebungsfaktoren und dem Kulturmedium abhängt, werden Bedingungen benötigt, die den Erhalt des undifferenzierten Zustand sowie die Proliferation der Zellen unterstützen. Das Ziel dieser Studie war es, die Zusammensetzung eines serumfreien und chemisch definierten Kulturmediums zu optimieren, welches die Expansion von humanen embryonalen Stammzellen (hESC) unterstützt. Hierbei wurden hESC repräsentativ für hPSC verwendet. In einem weiteren Aspekt wurde die Eignung der 3D-Vierkompartiment-Hohlfaser-Bioreaktortechnologie für die Zellexpansion in einem größeren Maßstab in einer kontrollierten Umgebung untersucht. Dabei wurden murine embryonale Stammzellen (mESC) als Modell-Zelllinie eingesetzt. Drittens wurde unter Verwendung von mESC ein Verfahren zum Ernten von sich vermehrenden embryonalen Stammzellen (ESC) entwickelt, um eine periodische Entnahme von Zellen aus der kontinuierlichen Perfusionskultur im Bioreaktor zu ermöglichen. Eine Auswahl von 17 Wachstumsfaktoren und Nährstoffen sowie die O2-Konzentration als Umgebungsfaktor wurde systematisch unter Verwendung von Design of Experiments (DoE)- Verfahren getestet. Die Ergebnisse aus der ersten Testreihe zeigten, dass der transforming growth factor ß (TGF-ß) den größten, signifikant positiven Einfluss auf die Proliferationsaktivität der feeder-abhängigen hESC hatte, während bovines Serumalbumin das Zellwachstum am meisten reduzierte. Im Gegensatz dazu ergab die weitere Analyse während der zweiten Testreihe, welche mit feeder-freien hESC durchgeführt wurde, dass die O2-Konzentration und Insulin den größten negativen Einfluss auf die Zellproliferation hatten, während Pipecolinsäure den größten signifikanten und positiven Einfluss hatte. Die anschließende Testung von zwei ausgewählten experimentellen Medien im Bioreaktor zeigte, dass beide Mediumvarianten die Expansion von feeder-freien hESC über eine Kulturdauer von 7 Tagen unterstützen, was durch den Glukoseverbrauch und die Laktatproduktion bestätigt wurde. Um ein mögliches Up-Scale der Zellexpansion unter Verwendung der 3D-Technologie zu untersuchen, wurde der zeitliche Verlauf der mESC Proliferation in drei Varianten des Bioreaktors mit verschiedenen Größen (0,5ml; 2ml oder 8ml Zellkompartimentvolumen) untersucht. Während die mESC in allen Bioreaktoren eine kontinuierliche Steigerung der Stoffwechselaktivität (Glukose, Laktat) über einen Zeitraum von bis zu 8 Tagen zeigten, wurde der höchste Anstieg in dem 2ml Bioreaktor beobachtet. Nach 4 bis 5 Tagen Kultur wurde eine Verringerung der Stoffwechselaktivität beobachtet. Dies deutet auf eine beginnende Differenzierung der Zellen hin, die durch immunhistochemische Analysen bestätigt werden konnte. Zum Ernten von vitalen Zellen aus dem Bioreaktorsystem wurde ein Verfahren etabliert, welches auf einer enzymatisch-mechanischen Behandlung basiert, und in Bezug auf den Spülmodus und die Intensität der mechanischen Einwirkung optimiert. Durch die Verwendung des optimierten Verfahrens konnte mit der ersten Ernte am Kulturtag 4 eine Anzahl von 380x106 Zellen aus dem Bioreaktor geerntet werden, was ungefähr dem 4-fachen der inokulierten Zellzahl entsprach. Am Kulturtag 7 konnten erneut 270x106 mESC aus dem Bioreaktor gewonnen werden. Die anschließende Kultivierung der geernteten Zellen bestätigte die Integrität, Sterilität und den undifferenzierten Zustand der Zellen. Zusammenfassend konnte durch die DoE-Methodik ein serumfreies und chemisch definiertes Kulturmedium für die Expansion von hESC systematisch optimiert und erfolgreich für die feeder-freie Kultur von hESC im Vier-Kompartiment-Bioreaktor angewandt werden. Die Ergebnisse zeigen auch, dass ein Up-Scale der Stammzellexpansion in dem 3D-Kultursystem durch Verwendung größerer Varianten des Bioreaktors möglich ist. Weiterhin wurde erfolgreich ein Verfahren zur Ernte von ESC etabliert, welches die fraktionierte Entnahme von Zellen aus dem System und somit ein längeres Wachstum der Zellen ermöglicht. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das optimierte Kulturmedium in Kombination mit der 3D-Kulturtechnologie auch für die Expansion anderer pluripotenter Stammzelltypen, wie z.B. von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC), Verwendung finden könnte. Die Möglichkeit, große Mengen von undifferenzierten Stammzellen herzustellen, ist von besonderem Interesse für die Gewinnung von aus Stammzellen abgeleiteten Zellpräparationen, welche im therapeutischen Bereich und/oder in der in vitro Forschung Anwendung finden.
Human pluripotent stem cells (hPSC) are a potential source for clinical and research applications in the field of regenerative medicine. Regarding these possible applications, a major challenge for researchers is the production of sufficiently large cell quantities. Since the in vitro culture behavior of pluripotent stem cells is strongly influenced by the culture conditions, including the environmental requirements as well as the culture medium, conditions that support the maintenance of the undifferentiated state as well as the proliferation of the cells are required. The aim of this study was to optimize the composition of a serum-free chemically defined culture medium intended to support the expansion of cultivated human embryonic stem cells (hESC), representative for hPSC. In a further aspect, the suitability of the four-compartment hollow-fiber based 3D-bioreactor technology for cell expansion at a larger scale in a controlled environment was investigated, using mouse embryonic stem cells (mESC) as model cell line. Third, a method for harvesting of growing embryonic stem cells (ESC) for enabling periodic removal of cells from continuous perfusion culture in the bioreactor was developed using mESC. A selection of 17 growth factors and nutrients, and also the O2 concentration as environmental factor was systematically screened using Design of Experiments (DoE) methods. The results from the initial screening performed showed that transforming growth factor ß (TGF-ß) had the most significant positive influence on the proliferation activity of feeder-dependent hESC, while bovine serum albumin reduced the cell growth mostly. In contrast, the further analysis by the second screening design, using feeder-free hESC, revealed that O2 concentration and insulin had the most negative influence on cell proliferation, while pipecolic acid had the most significant positive influence. The subsequent testing of two selected experimental media in the bioreactor showed that both medium variants support the expansion of feeder-free hESC over 7 days of cultivation, as confirmed by the glucose consumption and lactate production. In order to investigate the possibility of up-scaling cell expansion by using the 3D-technology, the time-course of mESC proliferation was studied in three different size variants (cell compartment volume: 0.5mL, 2mL or 8mL) of the bioreactor. While mESC in all bioreactors showed a continuous increase of metabolic activity (glucose, lactate) up to 8 days, the highest increase was observed in the 2mL bioreactor. After 4 to 5 days of culture, a decelerated increase was observed, indicating beginning differentiation of the cells, as confirmed by immunohistochemical analysis. For harvesting of vital cells from the bioreactor system, a method based on enzymatic-mechanical treatment was established and optimized with respect to the flushing mode and mechanical agitation intensity. By using the optimized method, a number of 380x106 cells, corresponding to nearly 4-fold of the inoculated cell number, could be removed from the bioreactor with the first harvesting on culture day 4 and on day 7 again 270x106 mESC could be harvested. In addition, subsequent cultivation of harvested cells confirmed the integrity, sterility and the undifferentiated state of the cells. In conclusion, a serum-free chemically defined culture medium for expanding hESC was systematically optimized by means of DoE methodology and successfully applied to feeder-free cultivation of hESC in four-compartment bioreactors. The results also indicate that an up-scaling of stem cell expansion in the 3D-culture system, using larger variants of the bioreactor, is possible. Furthermore, a method for harvesting of ESC was successfully established, which enables fractionated cell removal from the system and allows for prolonged proliferation of cells. The results suggest that the optimized culture medium in combination with the 3D-culture technology could also be useful for the expansion of other pluripotent stem cell types, e.g. induced pluripotent stem cells (iPSC). The possibility of producing large amounts of undifferentiated stem cells is of particular interest for the derivation of stem cell-derived cell preparations to be used in the therapeutic field and/or in vitro research.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-37991
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/3752
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3455
Exam Date: 14-Dec-2012
Issue Date: 19-Dec-2012
Date Available: 19-Dec-2012
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): 3D-Bioreaktorkultur
Design of Experiments
Embryonale Stammzellen
Kulturmedienoptimierung
3D-bioreactor culture
Culture medium optimization
Design of Experiments
Embryonic stem cells
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