Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3480
Main Title: Untersuchungen der intramolekularen Kopplungsprozesse der spannungssensitiven Phosphatase Ci-VSP
Translated Title: Investigation of the intramoleculare coupling process of the voltage sensitive phosphatase Ci-VSP
Author(s): Hobiger, Kirstin
Advisor(s): Friedrich, Thomas
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Phosphatidylinositol-Phosphate (PIP) sind an einer Vielzahl intrazellulärer Signalkaskaden beteiligt. Funktionseinschränkungen von Proteinen, die in den PIP-Metabolismus eingreifen, führen zu schweren Krankheiten, wie z.B. Krebs. Die spannungssensitive Phosphatase Ci-VSP aus der Seescheide Ciona intestinalis ist ein Modellprotein, an dem PIP-selektive Katalysemechanismen auf molekularer Ebene untersucht werden. Ci-VSP besteht aus zwei funktionellen Modulen: (1.) einer transmembranen Spannungssensor- (VSD) und (2.) einer zytosolischen katalytischen Domäne (CD), die nochmals in eine Phosphatase- (PD) und eine C2-Domäne unterteilt wird. Beide Module sind über die mehrfach positiv geladene Linkersequenz M240-K257 miteinander verbunden. Bei depolarisierenden Membranpotentialen laufen in der VSD Konformationsänderungen ab, die zur Aktivierung der PD führen, wodurch sie selektiv die Kopfgruppen von PIP-Membranlipiden dephosphoryliert. Im VSD-CD-Kopplungsprozess spielt der Linker eine essentielle Rolle, da er nach der Aktivierung der VSD über elektrostatische Wechselwirkungen an die negativ geladene Membranoberfläche bindet und dabei die CD an die Membran rekrutiert, wodurch die enzymatische Katalyse initiiert wird. Um die funktionelle Rolle des Linkers detaillierter aufzuklären, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Cystein-Scanning-Mutagenese der gesamten M240-K257-Sequenz durchgeführt. Die generierten Mutanten wurden in den Oozyten des Krallenfroschs Xenopus laevis heterolog exprimiert und elektrophysiologisch mittels der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme charakterisiert. Die Analyse der PD-Aktivität erfolgte in Koexpressionsexperimenten mit den PI(4,5)P2-sensitiven Kaliumkanälen KCNQ2/KCNQ3. Zudem wurde die VSD-Dynamik aller Ci-VSP-Mutanten untersucht. Hierbei wurde festgestellt, dass sich N-terminale Linkermutationen (M240C-K257C) weniger dramatisch auf die VSD-CD-Interaktion auswirken als C-terminale (Q250C-K257C). Mit A242C, R245C, K252C und Y255C wurden vier Konstrukte mit einer vollständig aufgehobenen PD-Aktivität identifiziert. Aufgrund der Periodizität des Mutationseffekts im N- und C-terminalen Linker wurden alpha-helikale Strukturelemente in diesen Bereichen vermutet. Außer K252C wiesen alle katalytisch inaktiven Mutanten zudem eine beschleunigtere VSD-Kinetik auf als das unmutierte Protein (Wildtyp). Durch die K257Stop-Mutante, bei der die CD des Proteins deletiert war, konnte nachgewiesen werden, dass der Verlust der CD-Membranbindung die Beschleunigung der VSD-Kinetik hervorrief. Hieraus wurde geschlussfolgert, dass die Mutationen A242C, R245C und Y255C die Proteinmodule voneinander entkoppeln. Im Gegensatz dazu wies die katalytisch inaktive Mutante K252C eine dem Wildtyp ähnliche VSD-Kinetik auf und schien somit nicht für die Membranbindung der CD verantwortlich zu sein. Daher wurde vermutet, dass der Linker noch andere Prozesse als nur die Membranbindung der CD vermitteln könnte. Um diese Frage zu klären, wurde ein dreidimensionales Homologiemodell der Ci-VSP-Struktur konstruiert, dessen Dynamik simuliert wurde. Anhand der Simulationsergebnisse konnte bekräftigt werden, dass sich im gesamten, überwiegend alpha-helikal strukturierten Linker Aminosäuren befinden, die über Salzbrücken mit den negativ geladenen Lipidkopfgruppen an der Membran interagieren. Hierbei spielt R245 eine besondere Rolle, da die Interaktionen dieser Seitenkette mit der Membran einen strukturellen Bruch im Linker verursachen, wodurch sich der C-terminale Linkerbereich zur PD hin ausrichtet und sich Salzbrücken zwischen K252, R253 im Linker und D400 und E402 in der PD ausbilden. D400 und E402 befinden sich dabei in einem von drei Loopregionen, die die katalytische Bindungstasche der PD bilden und stabilisieren, dem TI-Loop. Von den Wechselwirkungen zwischen Linker und TI-Loop wurde die R253-D400-Salzbrücke als die kritischste für die Ci-VSP-Funktionalität identifiziert, da Mutationen beider Positionen zu einer Modulentkopplung führten, was sich in einer nahezu aufgehobenen PD-Aktivität und einer beschleunigten VSD-Kinetik widerspiegelte. Weitere Untersuchungen zeigten auf, dass der Kontakt zwischen Linker und TI-Loop neben den elektrostatischen auch durch hydrophobe Interaktionen stabilisiert wird, die insbesondere durch die Aminosäuren Y255 im Linker und F401 im TI-Loop vermittelt werden. Zudem stabilisieren auch die negativ geladenen Kopfgruppen an der Membranoberfläche die Interaktion zwischen Linker und TI-Loop. Anhand der hier erhaltenen Daten wurde eine Hypothese über den Ablauf des linkervermittelten VSD-CD-Kopplungsprozesses entwickelt, bei dem die Interaktionen zwischen Linker und TI-Loop entscheidend für die Formierung der katalytischen Bindungstasche und somit für die Aufrechterhaltung der enzymatischen Aktivität der PD ist. Mit diesen Ergebnissen wird das Wissen über den spannungsabhängigen Aktivierungsmechanismus des Ci-VSP-Proteins erweitert und vertieft.
Phosphatidylinositol phosphates (PIP) are involved in a variety of intracellular signaling cascades. Proteins intervening in these pathways are of huge interest in medical research, because their insufficient functionality is associated with the development of serious diseases, e.g. cancer. The voltage sensitive phosphatase Ci-VSP from the ascidian Ciona intestinalis is one model system to investigate PIP-selective catalysis on a molecular level. Ci-VSP consists of two functional modules: (1.) a transmembrane voltage sensor domain (VSD) and (2.) a cytosolic catalytic domain (CD), which comprises a phosphatase (PD) and a C2-domain. Both modules are connected via the highly positively charged linker sequence M240-K257. Upon depolarization of the plasma membrane, conformational changes of the VSD lead to the activation of the PD, which selectively dephosphorylates PIP-lipids at the membrane surface. For the coupling process between VSD and CD, the linker seems to play a crucial role, because it could interact electrostatically with the negatively charged membrane surface during the activation of the VSD, which results in the recruitment of the CD to the membrane and therefore in the initiation of enzymatic catalysis. To investigate the role of the linker for the intermodular coupling process in more detail, a cysteine scanning mutagenesis of the whole sequence M240-K257 was carried out in this work. The different Ci-VSP mutants were heterologously expressed in the oocytes of the claw frog Xenopus laevis and functionally characterized by the two-electrode voltage-clamp technique. The PD activity was analyzed in coexpression experiments with the PI(4,5)P2-sensitive potassium channels KCNQ2/KCNQ3. Additionally, the mutation effect on the VSD dynamics was studied for all Ci-VSP mutants. In this work, it can be demonstrated that mutations in the N-terminal linker (M240C-S249C) are less destructive for the module interaction in Ci-VSP than mutations in the C-terminal sequence (Q250C-K257C). With A242C, R245C, K252C, and Y255C, four linker mutants were identified with a completely abolished PD activity. Because the mutation effect occurred periodically, alpha-helical elements in the linker region were proposed. Except for K252C, all inactive mutants showed faster VSD kinetics than the unmutated protein (wild type). The results of the K257Stop-mutant, in which the cytosolic domain was deleted, clarified that an increase in VSD flexibility is due to a lack of membrane binding of the CD. Therefore, it was concluded that the mutations A242C, R245C, and Y255C lead to an uncoupling of the VSD and CD. On the contrary, the inactive K252C-mutant showed almost identical VSD kinetics to the wild type indicating that K252 is not critical for the membrane binding of the CD. Therefore, it was presumed that this position is involved in other processes than electrostatic interactions with the membrane to enable the enzymatic catalysis. To shed more light into this question, a three-dimensional homology model of Ci-VSP was constructed, whose structural dynamics was predicted by molecular dynamics simulations. With the simulation results, it could be confirmed that several amino acids of a mainly alpha-helical structured linker interact electrostatically with the negatively charged membrane surface. The position R245 was identified to play a special role in this interaction, since the formation of salt bridges between R245 and phosphate groups of PIP at the membrane led to a structural break in the M240-K257-motif and therefore to a spatial approach of the C-terminal linker to the PD. In this way, stable salt bridges were formed between K252 and R253 in the linker and D400 and E402 in the PD. Interestingly, the positions D400 and E402 are localized in the TI loop, which is one of three loop regions that form the substrate binding pocket of the PD. From all interactions, the salt bridge between R253 and D400 seems to be the most crucial one for the VSD-CD interplay, because mutations of both positions led to a uncoupling of the Ci-VSP modules which is mirrored in a strongly reduced PD activity and fast VSD kinetics. In addition to this salt bridge, the connection between linker and TI loop is further stabilized by hydrophobic interactions that involve the residues Y255 in the linker and F401 in the PD. Moreover, the negatively charged head groups of membrane lipids further stabilize the interactions in the linker-TI loop interface. Based on these results, a hypothesis about the linker-mediated coupling process was developed, in which the formation of correct interactions between linker and TI loop is the essential step for those conformational changes in the PD that are required for initiating the enzymatic catalysis. In summary, the findings of this work broaden and deepen the knowledge about the voltage-dependent activation process in the Ci-VSP protein.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-38248
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/3777
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3480
Exam Date: 21-Dec-2012
Issue Date: 17-Jan-2013
Date Available: 17-Jan-2013
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): Lipidsignaltransduktion
Phosphoinositide
PTEN
Spannungssensor
Transmembrane Phosphatase
Lipid signaling
Phosphoinositides
PTEN
Transmembrane phosphatase
Voltage sensor
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