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Main Title: Approach for production of sensitive to oxidation and aggregating proteins in E. coli at the example of a heterologous ribonuclease inhibitor
Translated Title: Ansatz zur Herstellung oxidationssesitiver agregierender Proteine in E. Coli am Beispiel einer heterogenen Ribonuclease Inhibitors
Author(s): Šiurkus, Juozas
Advisor(s): Neubauer, Peter
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Die Mitglieder der Gruppe der Angiogenin/Ribonucklease-Inhibitoren (RIs) sind in heterologen Wirten schwierig zu exprimieren. In der vorliegenden Arbeit werden verschiedene Strategien beschrieben, mit denen RI mittels der Fed-batch Fermentation produziert werden können. Diese verschiedenen Strategien resultieren in hohen Produktionausbeuten, (a) als lösliches Fusionsprotein mit Maltosebindungsprotein (MBP), oder als korrekt prozessiertes Protein (b) im Periplasma, bzw. (c) im Zytoplasma. Für das Scale-up aller Prozesse wurde die Fed-batch Technologie in Form der enzymbasierten Substratfreisetzung (EnBase®) angewandt, die es erlaubt, den Wachstumsmodus im Hochdurchsatzscreening und im Schüttelkolben, ähnlich wie im finalen Bioreaktor zu kontrollieren. Die angewendeten Kultivierungsstrategien erlauben unter Fed-batch Bedingungen eine schnelle und systematische Evaluierung der Faktoren, die die Faltung von RI beeinflussen, wie z.B. die Nutzung reduzierender Medienzusätze und/oder die Koexpression von molekularen Chaperonen. Auf der Basis dieser Daten konnten dann ohne weitere Optimierung die direkten Hochzelldichte-Fed-batch-Prozesse im Bioreaktor etabliert werden. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass die hier neu entwickelte Strategie zur Herstellung authentischen RIs, basierend auf der Modulation des Redox-Niveaus durch Zugabe von Dethiothreitol, auch für die Produktion anderer leicht aggregierender prokaryotischer und eukaryotischer Modellproteine vorteilhaft ist. Die aktuelle Studie dokumentiert, wie detailliertes physiologisches Wissen in Kombination mit Hochdurchsatz-Screening-Strategien erfolgreich für die systematische Entwicklung von Bioprozessen für Proteine mit kompliziertem Faltungsverhalten genutzt werden kann.
The group members of angiogenin/ribonuclease inhibitors (RI's) are difficult to produce proteins in heterologous hosts. Here we describe several RI fed-batch production process development and scale-up strategies, which resulted in high production levels of soluble RI as a cytoplasmic fusion protein with MBP, as a periplasmic correctly processed authentic RI, and an authentic RI in the cell cytoplasm. For scale-up of all processes the fed-batch cultivation technology was applied in the form of the EnBase® biocatalysis-based feeding system, allowing from the early screening steps to the final bioreactor process to maintain highly similar growth mode. The utilized cultivation strategies enabled a quick and systematic evaluation of the original RI folding approaches based on the utilization of reducing medium additives and/or the co-expression of molecular chaperones at the small scale fed-batch production mode. The obtained data allowed to develop an efficient RI production process at the high cell density in stirred-tank bioreactor. The newly developed RI folding approach, based on the cytoplasmic redox modulation by medium supplementation with dithiothreitol (DTT), was applied and verified for the production of several aggregate-prone eukaryotic and prokaryotic model proteins. The actual study shows how the knowledge in cell physiology combined with the high-throughput screening strategies can be successfully applied for a straightforward bioprocess development with the aim to produce proteins requiring sophisticated folding.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-37848
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/3788
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3491
Exam Date: 2-Jul-2012
Issue Date: 1-Feb-2013
Date Available: 1-Feb-2013
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): E. Coli
Heterogener Ribonuclease Inhibitor
E. col i
Heterologous ribonuclease inhibitor
Usage rights: Terms of German Copyright Law
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