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Main Title: Mechanisms of Bacillus spore germination and inactivation during high pressure processing
Translated Title: Mechanismen der Bacillus Sporen Keimung und Inaktivierung während der Hochdruckbehandlung
Author(s): Reineke, Kai
Advisor(s): Knorr, Dietrich
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Hochdruck in Kombination mit hohen Prozesstemperaturen ermöglicht es, hochwertige sterile Lebensmittel herzustellen. Da unter anderem die Inaktivierungsmechanismen bakterieller Sporen nicht vollständig geklärt sind, wird diese Technologie bisher noch nicht industriell verwendet. Ziel der Arbeit war es, das Keimungs- und Inaktivierungsverhalten von Bacillus subtilis Sporen sowie von isogenen mutierten Stämmen, denen ein Teil des Keimungsmechanismus fehlt, in einem großen Druck-Temperatur-Zeitbereich zu untersuchen. Für reproduzierbare Prozessbedingungen wurden alle Kinetiken unter isothermen und isobaren Bedingungen während der Druckhaltezeit erstellt. Zur Vermeidung systematischer Fehler durch Veränderungen im Medium wurde ein pH-Messsystem für bis zu 130 °C und 1 MPa zur Messung in flüssigen und pastösen Lebensmitteln entwickelt. Es zeigte sich nahezu keine Verschiebung im Dissoziationsgleichgewicht bis 130 °C für Phosphat-Puffer, weshalb dieser für thermische Inaktivierungen verwendet wurde. Ein relativ stabiler pKa-Wert unter Hochdruck konnte durch die Verwendung von ACES-Puffer gewährleistet werden. Nach den Behandlungen wurde der physiologische Zustand der Sporen durch Keimzahlbestimmungen, durchflusszytomtetrische Analysen und eine Quantifizierung der freigesetzten Menge an Dipicolinsäure (DPA) mittels HPLC bestimmt. Für elektronen-mikroskopische Untersuchungen erfolgte die Entwicklung einer Ionenstrahl-Schnittmethode, die es ermöglichte Strukturveränderungen im Inneren der Spore zu untersuchen. Durch diese Methoden konnte ein Inaktivierungsmechanismus für 150 MPa und 37 °C abgeleitet werden, welcher durch eine physiologische DPA-Ausschleusung ausgelöst wird, über eine Cortex-Hydrolyse und den Abbau der kleinen säurelöslichen Proteine (SASP) zu einer Inaktivierung führt. Eine Druckerhöhung auf 550 MPa verlangsamt die Keimung und ein SASP-Abbau ist nicht mehr möglich. Wird dieser Druck mit Temperaturen über 60 °C kombiniert, induziert dies eine schnelle DPA-Ausschleusung sowie eine Inaktivierung. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass unter diesen Bedingungen die empfindlichste Struktur die innere Sporenmembran ist. Unter Verwendung eines Differentialgleichungsmodells konnten Isokinetik-Druck-Temperatur-Diagramme für die DPA-Ausschleusung, die Bildung temperaturempfindlicher sowie inaktivierter Sporen berechnet werden. Es wurde bestätigt, dass der erste Schritt der Inaktivierung unter Hochdruck die Freisetzung von DPA ist. Ferner bestimmt die Prozesstemperatur oberhalb eines Grenzdruckes von 600 MPa die Keimungs- und Inaktivierungsgeschwindigkeit. Darüber hinaus ermöglichte das verwendete Berechnungsmodell, Kinetikdaten aus zwei verschiedenen Hochdruckanlagen miteinander zu vergleichen. Die Daten dieser Arbeit und die abgeleiteten Inaktivierungsmechanismen können dazu beitragen, diese vielversprechende Technologie zu kommerzialisieren und somit die Lebensmittelsicherheit zu erhöhen.
High pressure combined with elevated temperatures can produce low acid, commercially sterile and shelf-stable food. However, this promising sterilization technology has not yet been applied in industrial settings, which is largely due to the unknown inactivation mechanism of highly resistant bacterial spores. This study aimed to clarify the germination and inactivation behavior of Bacillus subtilis spores and isogenic mutant strains lacking part of the germination apparatus, within a wide pressure–temperature–time domain. To ensure reliable process conditions, all kinetic data were derived under isothermal and isobaric treatment conditions during pressure dwell time. To avoid any biasing errors in the experimental results caused by varying matrix conditions, a pH-measurement system for liquid and semi-solid foods up to 130 °C and 1 MPa was constructed. The use of this system showed that PBS buffer had nearly no shift of dissociation equilibrium up to 130 °C, and was therefore used for all thermal inactivation experiments. However, under high pressure ACES buffer was used, due to its relatively stable pKa value. After the treatment, the physiological state of each spore sample was analyzed using the plate count method and flow cytometry, and the amount of dipicolinic acid (DPA) released was quantified by HPLC. In order to optimize scanning electron microscopic evaluations, a focused ion beam section method was developed to investigate the internal structural changes in spores. Based on this set of methods, a mechanism was proposed in which 150 MPa at 37 °C induces a physiological-like DPA release, followed by cortex and small acid soluble protein (SASP) degradation, resulting in a subsequent inactivation. A pressure increase to 550 MPa retarded the completion of germination and disabled SASP degradation. High pressures in combination with high temperatures (≥ 60 °C) caused a rapid DPA release and spore inactivation. This suggests that the most sensitive structure under these conditions is the inner spore membrane. By using a multiresponse kinetic model, isorate pressure–temperature diagrams for the release of DPA, the formation of heat-sensitive and inactivated spores were calculated. It was confirmed that the first step of inactivation under high pressure is the release of DPA. Above a threshold pressure of 600 MPa the treatment temperature dominates germination and inactivation rate. The model used enabled the comparison of kinetic data derived in two different high pressure units with different compression rates. The kinetic data from this study and the suggested mechanisms can aid in optimizing this promising sterilization technology and will increase food safety.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-38858
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/3838
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3541
Exam Date: 19-Oct-2012
Issue Date: 20-Mar-2013
Date Available: 20-Mar-2013
DDC Class: 620 Ingenieurwissenschaften und zugeordnete Tätigkeiten
Subject(s): Bakterielle Sporen
Hochdruck
Mechanismen
Modellierung
Sterilisation
Bacterial spores
High pressure processing
Mechanisms
Modeling
Sterilization
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