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Main Title: Entwicklung einer robusten chemo-enzymatisch dynamisch kinetischen Racematspaltung für die nachhaltige Synthese chiraler α-Hydroxyketone
Translated Title: Development of a robust chemo-enzymatic dynamic kinetic resolution for sustainable synthesis of chiral α-hydroxy ketones
Author(s): Nieguth, René
Advisor(s): Schomäcker, Reinhard
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Ziel dieser Arbeit war die Weiterentwicklung der dynamisch kinetischen Racematspaltung (DKR) von Benzoin, was im Rahmen dieser Studie durch zwei Teilprojekte realisiert werden sollte: (1) Die Optimierung der kinetischen Racematspaltung sowohl auf der Seite der Biokatalysatorentwicklung als auch in der Prozessparameteroptimierung und (2) die Entwicklung einer alternativen Racemisierungsmethode zur "onepot" DKR von Benzoin. Abschließend wurde das neue DKR-Reaktionssystem charakterisiert und mit dem bisherigen Stand der Technik verglichen. Die Lipase TL aus Pseudomonas stutzeri wurde sehr erfolgreich auf das Trägermaterial Accurel MP1001 adsorptiv immobilisiert (Acc-LipTL). Dazu wurden der Einfluss der Proteinstartkonzentration, der Temperatur, der Pufferkonzentration und des pH-Wertes auf die Immobilisierung untersucht. Es war möglich die Effizienz der Immobilisierung aufgrund der Parameteroptimierung stark zu verbessern und dabei die spezifische Proteinaktivität der Lipase TL gegenüber der nativen Präparation zu erhöhen (Faktor 4,1). Innerhalb der Charakterisierung der Prozessparameter der kinetischen Racematspaltung konnte eine niedrige Wasseraktivität des Reaktionsansatzes als positiv bezüglich der Aktivität bestimmt werden. Die Untersuchungen alternativer Lösungsmittel zeigten für 2-MeTHF und Toluol höhere Aktivitäten als im Standardsystem THF. Bei den Messungen der Lagerstabilität konnte eine starke Temperatur- und Lösungsmittelsensitivität der Acc-LipTL festgestellt werden. Hierbei wirken die hydrophoben Lösungsmittel MIBK und Toluol als stark stabilisierend während einer Lagerung der Acc-LipTL. Zur Ermittlung der Prozessstabilität wurden sowohl wiederholte Batch-Versuche als auch Versuche in einem kontinuierlichen Prozess durchgeführt. Es wurden unterschiedliche Halbwertszeiten für diese Testsysteme gefunden, die jeweils deutlich niedriger waren, als die der Lagerstabilitäten. Beim Vergleich der Lösungsmittel im kontinuierlichen Prozess erwies sich 2-MeTHF als besonders stabilisierend auf Acc-LipTL. Zur nachträglichen Stabilisierung der Acc-LipTL wurden etablierte Protokolle zur physikalischen und chemischen Modifikation genutzt. Auf Basis der prozessnahen Untersuchungen im kontinuierlichen Reaktor wurden Polyethylenimin (PEI), aktiviertes Polyethylenglykol (mPEG) und eine Dextranmodifikation als die Methoden identifiziert, die die Stabilität gegenüber komplexen Inaktivierungseinflüssen erhöhen können. Im Screening nach alternativen Racemisierungskatalysatoren stellten sich TUD-1 Materialen und dabei insbesondere Zr-TUD-1 und Al-TUD-1 als außerordentlich aktiv heraus. In der folgenden "onepot" DKR mit den TUD-1 Katalysatoren und Acc-LipTL konnte erstmals eine DKR von Benzoin innerhalb von 5 h mit einem Umsatz von >98 % (ee >98 %) gezeigt werden. Die Rezyklierung der DKR mit Zr-TUD-1 und der modifizierten Acc-LipTL (PEI, mPEG, Dextran) ergab eine starke Steigerung der Stabilität der mit PEI modifizierten Acc-LipTL. Diese Immobilisate konnten mindestens 5-mal wiederverwendet werden, ohne dass der Umsatz unter 98 % (ee >98 %) abfiel. Der Vergleich der Prozesseffizienz gegenüber dem bisherigen System von Hoyos et al.(2008) ergab eine 6-fach höhere Produktausbeute pro immobilisiertes Protein.
The aim of this study was to further develop the dynamic kinetic resolution (DKR) of benzoin, which was realized within two part projects: (1) Optimization of the kinetic resolution (KR) from the aspect of bio-catalyst development as well as the characterization and optimization of process parameter and (2) the development of an alternative method for benzoin racemization for an application in a onepot DKR. Finally, the entire DKR-reaction system should be characterized and compared to the state of the art. The lipase TL from Pseudomonas stutzeri was successfully immobilized by adsorption on the carrier material Accurel MP1001 (Acc-LipTL). Within this immobilization procedure the impact of protein concentration, temperature, buffer concentration and pH was investigated. It was possible to both improve the immobilization efficiency and to increase the specific protein activity of the immobilized lipase TL compared to the native lipase by factor 4.1. By characterizing the KR-process parameter, a low water activity was found to have a positive effect on the activity. By investigating alternative organic solvents, 2-MeTHF and toluene were found to increase the activity compared to THF as standard solvent. Concerning the storage stability a strong solvent and temperature dependency was detected, whereby the hydrophobic solvents toluene and MIBK had a significant stabilizing effect on the storage of Acc-LipTL. For determining the process stability, a repetitive batch approach as well as a continuously stirred tank reactor were used. Surprisingly, different half times were found that were in both cases lower than the storage half times determined before. In terms of the solvent used in the process, 2-MeTHF was found to have a stabilizing effect on Acc-LipTL. In order to increase the stability of the Acc-LipTL, established protocols for chemical and physical modifications were applied. Investigated in the continuous process, the modifications of Acc-LipTL with polyethylenimine (PEI), activated polyethylene glycol (mPEG) and dextran were identified to increase the process stability. Within the screening for alternative racemization catalysts especially Zr-TUD-1 and Al-TUD-1 were determined to be very active in the racemization of (R)-benzoin. A following characterization of process parameters and possible side reactions in the racemization was done. By using the TUD-1 catalysts and the Acc-LipTL a DKR within 5 h with a yield of 98 % (ee >98%) was shown for the first time. The repetitive use of Zr-TUD-1 with modified Acc-LipTL resulted in a significant increase in process stability during DKR for the Acc-LipTL modified with PEI. The whole reaction system could be reused at least 5 times with yields each > 98 % (ee >98%). The comparison of process efficiency with the state of the art system from Hoyos et al. (2008) yielded in a 6-time higher product yield per amount of immobilized protein.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-39307
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/3851
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3554
Exam Date: 5-Apr-2013
Issue Date: 16-Apr-2013
Date Available: 16-Apr-2013
DDC Class: 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Subject(s): Dynamisch kinetische Racematspaltung
Enzym
Immobilisierung
Lipase
Racemisierung
Dynamic kinetic resolution
Enzyme
Immobilization
Lipase
Racemization
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