Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3608
Main Title: GDF3: a new player in cancer stem cell biology
Translated Title: GDF3: ein neuer Kandidat in der Krebsstammzellbiologie
Author(s): Tykwinska, Karolina
Advisor(s): Lauster, Roland
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: In vielen Krebszelltypen wird ein verändertes Expressionsmuster verschiedener Wachstumsfaktoren beobachtet. Dabei handelt es sich häufig um Proteine, die den Stammzellphänotyp der Zelle definieren. Dadurch werden verschiedene Parameter moduliert, die sich auf den Krankheitsfortschritt auswirken, wie Zellproliferation, Differenzierung, das Aufrechterhalten des undifferenzierten Phänotyps sowie Modulation des Immunsystems. Growth and Differentiation Factor 3 (GDF3) ist ein Zytokin aus der TGFβ Familie, das vor allem für die Pluripotenz embryonaler Stammzellen und während der frühen Embryonalentwicklung eine Rolle spielt. Obwohl seine Re-expression in Krebszellen nachgewiesen werden konnte, ist seine Funktion in der Tumorinitiation und -progression ungeklärt. Im Rahmen dieses Projektes, wurde die Rolle des GDF3 und seiner Signalkaskade in einem in vitro Krebsstammzell-Modell, NCCIT Zelllinie, untersucht. Mittels einer Überexpression chimärer Prekursormoleküle zur Untersuchung der Translation, Prozessierung und Sekretion konnte der entscheidende Einfluss der GDF3-Prodomäne auf die Bioverfügbarkeit des Zytokins demonstriert werden. Die GDF3-Prodomäne vermittelt einen rapiden Abbau des Liganden, was mit einer deutlichen Einschränkung des räumlichen und zeitlichen Wirkungsspektrums von GDF3 einhergeht. Außerdem wurden ein klassischer Ansatz zur Proteinfunktionsuntersuchung, ein modernes Hochdurchsatzverfahren zur Transkriptomanalyse und Differenzierungsassays eingesetzt, um das Potenzial von GDF3 als therapeutisches Target zu evaluieren. Es konnte gezeigt werden, dass GDF3 eine Reihe von differenzierungsassoziierten Geneinduziert, darunter auch potente Tumorsuppresorgene, wie HoxA9, HoxA10 and HoxB13, ohne die Proliferationskapazität der Zellen zu beeinflussen. Zusätzlich moduliert GDF3 die Expression einiger BMP-Liganden, -Rezeptoren und des extrazellulären Inhibitors Gremlin. Die Expression dieser Moleküle wird durch das Vorhandensein von GDF3 aufrecht erhalten und verringert sich, wenn GDF3 mittels shRNA runterreguliert wurde. Mittels Gene Ontology-Analyse und qPCR konnte auch ein Zusammenhang zwischen GDF3 und Angiogenese festgestellt werden. Die starke Tie2 Induktion, des Angiopoietin 1 und 2 Rezeptors, nach GDF3 knockdown weist auf eine Rolle von GDF3 als negativer Angiogenese-Regulator hin. Aufgrund der Feststellung, dass GDF3 die Expression von differenzierungs- und entwicklungsassoziierten Genen moduliert, wurde im nächsten Schritt die Differenzierungskapazität der NCCIT Zellen untersucht. Nach Stimulation mit Retinsäure wurde beobachtet, dass die Kontrollzellen erwartungsgemäß einer neuronalen Differenzierung, begleitet durch eine Verringerung der Proliferationsrate, durchlaufen. Die GDF3-knockdown Zellen hingegen leiteten verstärkt die Apoptose ein. Dies kann auf die differenzielle Induktion des anti-apoptotischen Faktors BCL2 zurückgeführt werden. BCL2 wird vermehrt exprimiert in den Kontrollzellen exprimiert, jedoch nicht in GDF3 knockdown-Zellen induziert. Dies ist die erste Studie, die über einen Schutzeffekt von GDF3 vor der Retinsäure-induzierten Apoptose berichtet. Eine Kombination aus Retinsäure und gleichzeitiger Blockade der GDF3 Signalkaskade könnte zur Entwicklung neuartiger Anti-Krebstherapien bzw. zum Re-design von Differenzierungstherapien eingesetzt werden.
Misexpression of growth factors, particularly those related to a stem cell-like phenotype, is often observed in several cancer types. It has been found to influence parameters of disease progression like cell proliferation, differentiation, maintenance of undifferentiated phenotype and modulation of the immune system. Growth and Differentiation Factor 3 (GDF3) is a TGFβ family member associated with pluripotency and differentiation during embryonic development, which has been previously reported to be re-expressed in a number of cancer types. However, its role in tumor development and progression has not been clarified yet. In this study a thorough analysis of GDF3 signalling was performed to decipher the role of GDF3 in an in vitro model of cancer stem cells, the NCCIT cells. The overexpression of chimeric precursors to track the translation, processing and secretion of the ligand, revealed that the bioavailability of GDF3 is tightly regulated by its prodomain. The prodomain mediates a rapid degradation of GDF3, limiting its spacial range and time of action. Using classical approaches to study protein function combined with high-throughput technique for transcriptome analysis and differentiation assays I evaluated GDF3 as a potential therapeutic target. I observed that GDF3 robustly induces a panel of genes related to differentiation, among which are several potent tumor suppressors, such as HoxA9, HoxA10 and HoxB13, without impacting the proliferative capacity. Additionally, the expression of several BMP ligands, BMP receptor and extracellular inhibitor Gremlin was affected. The expression of these molecules is sustained by the presence of GDF3 and drops upon GDF3 knockdown. The overrepresentation analysis of genes regulated by GDF3 as well as qPCR uncovered the previously unknown role of GDF3 in angiogenesis regulation. Tie2 is particularly strongly upregulated in the absence of GDF3, indicating involvement of this ligand in negative angiogenesis regulation. On the basis that GDF3 is involved in development and differentiation the capacity of NCCIT cells to in vitro differentiate upon stimulation with retinoic acid was exploited. It was observed that the level of BCL2, a pro-survival factor, was significantly upregulated in the control cells, which escaped the apoptosis as a consequence, while NCCIT cells with GDF3 knockdown failed to do so. I report for the first time the protective effect of GDF3 against retinoic acid-induced apoptosis in cells with stem cell-like properties. Furthermore, this study provides strong evidence that blocking of GDF3 combined with retinoic acid-treatment of solid cancers is a compelling direction for further investigations, which may lead to re-design of cancer differentiation therapies.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-39977
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/3905
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3608
Exam Date: 17-May-2013
Issue Date: 27-May-2013
Date Available: 27-May-2013
DDC Class: 500 Naturwissenschaften und Mathematik
Subject(s): Differenzierung
GDF3
Krebs
Krebsstammzellen
Cancer
Cancer stem cell
Differentiation
GDF3
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