Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3624
Main Title: Genetische und enzymatische Charakterisierung der Biosynthese des Actinomycins in Streptomyces
Translated Title: Genetic and enzymatic characterization of the actinomycin biosynthesis in Streptomyces
Author(s): Crnovcic, Ivana
Advisor(s): Keller, Ullrich
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Die Actinomycine, eine Gruppe cytostatisch wirksamer Chromopeptide, werden von verschiedenen Streptomyces Stämmen gebildet. Ihre Struktur ist geprägt durch eine Dimethyl-Phenoxazinon-Dicarbonsäure, welche in Amidbindungen mit zwei Pentapeptidlactonringen verknüpft ist. Die Bildung des Phenoxazinon-Chromophors findet im letzten Schritt der Actinomycin-Biosynthese statt, wenn zwei 3-Hydroxy-4-methylanthraniloyl-(4-MHA)-Pentapeptidlacton-Zwischenstufen oxidativ miteinander kondensiert werden. Enzymatische und genetische Arbeiten in Streptomyces chrysomallus haben die Schritte des Aufbaus der 4-MHA Pentapeptidlactone an den multifunktionellen Actinomycin Synthetasen aus den Pentapeptidlactonring-Aminosäuren und 4-MHA geklärt. Dagegen waren die Schritte der Biosynthese der 4-MHA nur teilweise auf enzymatischer Ebene charakterisiert und die verantwortlichen Gene unbekannt. Die Sequenzanalyse des Actinomycin-Biosynthese-Genclusters von S. chrysomallus führte zur Auffindung von 4-MHA Biosynthese Genen wie für Tryptophandioxygenase (acmG), Kynureninformamidase (acmF) und Hydroxykynureninase (acmH). Die betreffenden Enzymaktivitäten konnten durch vergleichende enzymatische Analysen von Zellextrakten des Actinomycin-produzierenden Wildtyp-Stamms und einer Actinomycin-negativen Mutante, in der diese Gene deletiert waren, identifiziert und von den entsprechenden katabolischen Enzymen des Primärstoffwechsels funktionell unterschieden werden. Weitere als Methyltransferase Gene annotierte Gene (acmI und acmL) wurden heterolog in E. coli exprimiert. Testung von AcmI und AcmL ergab, dass sie 3-Hydroxykynurenin (3-HK) zu 3-Hydroxy-4-methylkynurenin (4-MHK) aber nicht die 3-Hydroxyanthranilsäure (3-HA) zu 4-MHA - wie Daten früherer Arbeiten eigentlich voraussagten - methylieren. Demgemäß resultierte Zugabe von überschüssiger 3-HA zu S. chrysomallus und Streptomyces parvulus als auch zu Streptomyces antibioticus keine Stimulierung der Actinomycinsynthese. Stattdessen wurde die im Überschuss vorliegende 3-HA aufgrund ihrer strukturellen Homologie anstelle der intrazellulären 4-MHA in den Phenoxazinon-Chromophor neuer Actinomycine, der C-Demethylactinomycine, eingebaut. Darüber hinaus induzierte die 3-HA in S. antibioticus zusätzlich die Bildung von neuen C-Demethyl-hemi-Actinomycinen, die nur einen statt zwei Pentapeptidlactonringen am Phenoxazinonchromophor tragen. Entsprechend resultierte die Fütterung von S. antibioticus mit überschüssiger 4-MHA in der Bildung von Hemiactinomycinen. Letztere und die Demethyl-hemi-Actinomycine entstehen durch oxidative Kondensation im Überschuss präsenter 3-HA oder 4-MHA mit vorgebildeten Actinomycinhälften. Diese Reaktionen werden offensichtlich von der Phenoxazinon Synthase (PHS) in S. antibioticus katalysiert, die in S. chrysomallus oder S. parvulus nicht vorkommt. Weitere enzymatische und kinetische Charakterisierungen von AcmI und AcmL zeigten, dass sie neben ihrem eigentlichen Substrat, 3-Hydroxy-D-Kynurenin, auch andere phenolische Aminosäuren mit neuartiger antipodaler Stereospezifität am aromatischen Kern methylieren. Diese wird bestimmt von der optischen Konfiguration am alpha-C und gleichzeitig der unterschiedlichen Länge der aliphatischen Aminosäureseitenkette. Wildtyp AcmI/AcmL wurden auch in Zellextrakten von S. chrysomallus nachgewiesen, in welchen sie zusammen mit Hydroxykynureninase die Konversion von 3-HK (über 4-MHK) in 4-MHA katalysierten. Die in geringem Ausmaß stattfindende vorzeitige Spaltung von 3-HK in 3-HA durch Hydroxykynureninase ist Grund für das Vorkommen von Spuren von C-Demethylactinomycinen in natürlichen Actinomycingemischen.
Actinomycins are a family of bicyclic chromopeptides with cytostatic activity produced by various streptomycetes. In their structures, two pentapeptide lactone rings are attached to a dimethyl-phenoxazinone-di-carboxylic acid in amide linkage. Biosynthetic studies in Streptomyces chrysomallus had shown earlier that phenoxazinone formation takes place during the last step of actinomycin synthesis by condensation of two 3-hydroxy-4-methylanthraniloyl (4-MHA) pentapeptide lactones (actinomycin half molecules). The 4-MHA pentapeptide lactones are assembled from 4-MHA and the amino acids of the pentapeptide lactone rings by a set of four non-ribosomal peptide synthetase subunits (actinomycin synthetases, ACMS). In contrast to actinomycin assembly, the steps of 4-MHA biosynthesis were less clear and the genes encoding these enzymes were as yet not known. Sequence analysis of DNA-regions flanking the NRPS genes of the actinomycin biosynthetic gene cluster from S. chrysomallus revealed genes encoding proteins with similarity to tryptophan dioxygenase, kynurenineformamidase, and hydroxykynureninase most probably involved in the biosynthesis of 4-MHA. Comparative enzymatic analysis of the corresponding enzyme activities in S. chrysomallus and the knockout mutant S. chrysomallus-white clearly distinguished these pathway specific enzymes from their homologues involved in cellular tryptophan catabolism and proved their involvement in 4-MHA synthesis. In addition, the gene cluster contained two paralogous genes, acmI and acmL, both encoding two nearly identical methyltransferases. Both genes were expressed in E. coli. Testing the resultant purified proteins revealed that each exclusively methylated 3-hydroxykynurenine (3-HK) with formation of 3-hydroxy-4-methylkynurenine (4-MHK) but not 3-hydroxyanthranilic acid (3-HA) to 3-hydroxy-4-methylanthranilic acid (4-MHA). Further analysis of these enzymes showed that they can methylate other phenolic amino acids, too, such as tyrosine but at a lower rate than 3-HK. The methylation reactions were stereospecific depending on the length of the amino acid side chain of these substrates resulting in exclusive methylation of 3-hydroxy-D-kynurenine (or homo-D-tyrosine) or of L-tyrosine (meta-L-tyrosine). Testing protein extracts of S. chrysomallus actively synthesizing actinomycins showed that they catalysed methylation of 3-HK whereas methylation of 3-HA was not observed. This proved that acmI and/or acmL were expressed during actinomycin synthesis. Moreover, external addition of 3-HA to actinomycin-producing S. chrysomallus, Streptomyces parvulus and Streptomyces antibioticus did not stimulate actinomycin synthesis but resulted in the formation of novel compounds, C-demethylactinomycins, due to incorporation of 3-HA into actinomycins instead of the structurally similar 4-MHA. This proved again, that 3-HK is precursor of 4-MHA rather than 3-HA. In addition, external addition of 3-HA and also of 4-MHA to S. antibioticus cultures led to the formation of as yet unknown novel actinomycin and demethylactinomycin homologues, hemiactinomycins, which contain only one pentapeptide lactone ring due to premature condensation of 3-HA or 4-MHA with actinomycin halves. Most probably the formation of these hemi-compounds is catalyzed by phenoxazinone-synthase (PHS) of S. antibioticus because S. chrysomallus or S. parvulus, both lacking PHS activity, do not produce hemiactinomycin and C-demethylactinomycin when fed with 3-HA or 4-MHA.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-39988
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/3921
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3624
Exam Date: 19-Apr-2013
Issue Date: 31-May-2013
Date Available: 31-May-2013
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): Actinomycin
Biosynthese
Streptomyces
Actinomycin
Biosynthesis
Streptomyces
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