Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3627
Main Title: Die enzymatische Cyclolisierung der D-Lysergsäurealkaloidpeptide aus dem Mutterkornpilz Claviceps purpurea
Translated Title: The enzymatic cyclolization of D-lysergic acid alkaloid peptides from the ergot fungus Claviceps purpurea
Author(s): Havemann, Judith
Advisor(s): Keller, Ullrich
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Untersuchungen der Bildung der Alkaloidpeptide vom Cyclol-Typ (Ergopeptine) in Claviceps purpurea zeigten, dass deren Peptidgrundgerüst von den nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NPRS), LPS1 und LPS2, aufgebaut wird. Diese verknüpfen die D Lysergsäure mit drei Aminosäuren zu einem thioestergebundenen D-Lysergyltripepid, welches in in-vitro-Bedingungen als D-Lysergyltripeptidlactam (z.B. im Falle des Ergotamins als N-(D-Lysergyl-Alanyl)-Phenylalanyl-Prolin-Lactam) von der LPS1 freigesetzt wird. Die Bildung des Cyclol-Endprodukts (Ergopeptin) bzw. die Cyclolisierung von D Lysergyltripeptidlactamen zu Ergopeptinen konnte bisher nicht erreicht werden. Dagegen wird hier ein enzymatisches in-vitro-Totalsynthesesystem für alle drei in der Natur vorkommenden Ergopeptinklassen vorgestellt. Es fußt auf einem schonend hergestellten Zellextrakt des Alkaloid-Hochproduzenten C. purpurea D11, welcher sowohl unfraktioniert als auch nach Anreicherung durch schnelle Fraktionierungsschritte die Bildung von z.B. von Ergotamin aus D-Lysergsäure, Alanin, Phenylalanin und Prolin in ATP-, Fe(II)- und α-Ketoglutarat-abhängiger Weise katalysiert. Dissektion des Systems in seine enzymatischen Einzelkomponenten durch Gelfiltration ermöglichte die Identifikation der Cyclolisierungsaktivität gegenüber den ausschließlich D-Lysergyltripeptidlactam synthetisierenden Peptidsynthetasen LPS1/LPS2 als eigenständige Fe(II)/α-KG abhängige Dioxygenase (Cyclol-Synthase). Homologievergleiche der Gene des Ergotalkaloid-Biosynthese-Genclusters aus C. purpurea führten schließlich zur Auffindung eines Gens easH1 als Kandidatengen für die cycloliserende Fe(II)/α KG-abhängige Dioxygenase. Die Expression dieses Gens als His6-Fusionsprotein EasH lieferte ein Protein des Mr 36.500, das als Dimer einer Molekülmasse von 71,4 kDa rein erhalten wurde. Koinkubation von rekombinantem EasH mit Wildtyp-Dioxygenase-freien Peptidsynthetasen LPS1/LPS2 und allen notwendigen Substraten einschließlich Fe(II) und α KG resultierte in der Vollsynthese von Ergotamin. Dies beweist, dass EasH das cyclolisierende Enzym ist. Untersuchungen zum Schritt des Cyclolbildung ergaben, dass EasH alle drei natürlichen Klassen von D-Lysergyltripeptidlactamen direkt in die entsprechenden Ergopeptine konvertieren kann. Auslösender Schritt ist die Hydroxylierung der ersten Aminosäure in der Tripeptidlactam-Kette. Anschließende spontane Kondensation der Hydroxylgruppe mit der carboxyterminalen Prolyl-Lactam-Carbonylgruppe generiert die Esterbindung und die tertiäre Hydroxylgruppe der Cyclolgruppierung. Die Analyse thioestergebundener D Lysergylmonopeptid- und D Lysergyldipeptid-Zwischenstufen auf der Peptidsynthetase LPS1 ergab, dass sie durch EasH nicht hydroxyliert werden. Jedoch konnte die Hydroxylierung der thioestergebundenen D Lysergyltripeptid-Zwischenstufe nicht ausgeschlossen werden. Umsetzung von EasH mit synthetischen Dihydrolysergyl-Alanyl-Phenylalanyl-Prolyl-Coenzym A, -Pantethein oder -N Acetylcysteamin (SNAC) Thioestern resultierte in deren Hydroxylierung. Jedoch reagierten die hydroxylierten Peptidthioester spontan zum Dihdrolysergyltripeptidlactam und weiter zum Cyclol. Dies weist auf einen konzertierten Ablauf der Schritte der Hydroxylierung und Lactamring-Bildung hin, der möglicherweise auch eine Bedeutung in der Cycloliserungsreaktion in vivo hat.
Studies on the formation of alkaloid peptides of the cyclol type (ergopeptines) in Claviceps purpurea showed that the peptide backbone is assembled by the nonribosomal peptide synthetases LPS1 and LPS2. The LPS subunits assemble D-lysergic acid and three amino acids to D-lysergyl tripeptide bound to LPS1 as thioester. This D-lysergyl tripeptide is released from LPS1 as D-lysergyl tripeptide lactam under in vitro conditions (e.g. in the case of ergotamine as N-(D-lysergyl-alanyl)-phenylalanyl-proline-lactam). To date, neither the formation of the end product (cyclol) nor the cyclolization of the D-lysergyl tripeptide lactam to ergopeptines could be observed. Here, an enzymatic in vitro total synthesis system for all three classes of naturally occurring ergopeptines is presented. It is based on a cell extract of the alkaloid high-producer strain C. purpurea D11. This extract both unfractionated and after being concentrated due to fast fractionation steps catalyzes the formation of e.g. ergotamine from D-lysergic acid, alanine, phenylalanine and proline in an ATP-, Fe(II)- and α-ketoglutarate-dependent manner. Dissection of the system into its enzymatic components through gel filtration allowed the identification of the cyclolizing activity as a discrete Fe(II)/α-ketoglutarate-dependent dioxygenase (cyclol synthase) in contrast to the exclusively D-lysergyl tripeptide lactam synthetizing peptide synthetases LPS1/LPS2. Sequence analysis of the genes of the ergot alkaloid biosynthesis gene cluster from C. purpurea eventually led to the discovery of a gene easH1 as a candidate for a cyclolizing Fe(II)/α-ketoglutarate-dependent dioxygenase. The gene easH1 was expressed as a soluble His6-fusion protein with a Mr of 36,500 that could be obtained as a dimer with the molecular weight of 71.4 kDa. Testing the enzyme in conjunction with the purified LPS1/LPS2 fraction (devoid of wild type dioxygenase activity) and all necessary substrates including Fe(II)/α-KG resulted in ergotamine synthesis. This indicated that EasH is the cyclolizing enzyme. Analysis of the biosynthetic step leading to cyclol formation showed that EasH converts all three naturally occurring classes of D-lysergic tripeptide lactams into the corresponding ergopeptines. The reaction is triggered by hydroxylation of the first amino acid of the tripeptide lactam chain. Subsequent spontaneous condensation of the hydroxyl group with the carboxyterminal prolyl-lactam carbonyl group generates the ester bond and the tertiary hydroxyl group of the cyclol. Analysis of D-lysergyl monopeptide and D-lysergyl dipeptide enzyme-thioester intermediates bound to the peptide synthetase LPS1 showed that these intermediates do not become hydroxylated by EasH. However, the hydroxylation of D-lysergyl tripeptide enzyme thioester intermediate could not be ruled out. Testing of EasH with chemically synthetized dihydrolysergyl-alanyl-phenylalanyl-prolyl Coenzyme A, pantetheine or N-acetyl cysteamine thioester resulted in their hydroxylation. However, the hydroxylated peptide thioesters spontaneously reacted to dihydrolysergyl tripeptide lactam and further to the cyclol. This indicates a concerted mechanism of hydroxylation and lactam formation, which is possibly of significance in the cyclolizing reaction in vivo.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-40034
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/3924
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3627
Exam Date: 19-Apr-2013
Issue Date: 31-May-2013
Date Available: 31-May-2013
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): Biosynthese
Claviceps purpurea
Cyclole
Dioxygenase
Ergotalkaloidpeptide
Biosynthesis
Claviceps purpurea
Cyclols
Dioxygenase
Ergot alkaloid peptides
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