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Main Title: Smooth muscle titin in embryo implantation and angiogenesis
Translated Title: Titin im Glatten Muskel in Embryo-Implantation und Angiogenese
Author(s): Bergmann, Nora
Advisor(s): Gotthardt, Michael
Stahl, Ulf
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Das Muskelprotein Titin ist mit einem Molekulargewicht von bis zu 3700 kDa das größte bekannte Polypeptid. Es ist nach Aktin und Myosin das dritthäufigste Protein im quergestreiften Muskel. Titin integriert in die Z-Scheibe und die M-Bande und überspannt damit das halbe Sarkomer. Es formt ein elastisches Gerüst entlang der Muskelfaser und ist sowohl an Signaltransduktion als auch mechanischer Stabilität und Erhaltung der Sarkomerstruktur beteiligt. Während Titin im quergestreiften Muskel bereits eingehend untersucht wurde, ist seine Funktion im glatten Muskel unbekannt, obwohl Titin im glatten Muskel auf Transkriptions- und Proteinebene beschrieben ist. Um Titin im glatten Muskel zu untersuchen, haben wir ein Knockin-Mausmodell etabliert, in dem der Amino-Terminus von Titin mit Hilfe des Fluoreszenzprotein DsRed markiert wurde. Die Analyse von quergestreiftem Muskel der Titin-DsRed-Mäuse bestätigte die DsRed-Integration in Titin am Übergang von der Z-Scheibe zur I-Bande des Sarkomers. Diese Modifizierung verursachte keinen offensichtlichen Phänotyp hinsichtlich Lebensfähigkeit, Herzgewicht und Einbau von Titin in das Sarkomer. Die Verwendung des DsReds ermöglicht Live-Cell-Imaging und die DsRed-Detektion, so dass unser Knockin-Mausmodell ideal geeignet ist, um Titin im glatten Muskel zu lokalisieren. Von besonderem Interesse ist Titin im Uterus, da wir Titin im glatten Muskel erstmalig eine funktionelle Rolle während der Schwangerschaft zuweisen konnten. Dazu haben wir ein konditionelles Knockout-Modell verwendet. In diesem wurden Titins M-Banden Exons 1 und 2, die die Titin-Kinase-Region codieren, mit Hilfe einer Cre-Rekombinase effizient im glatten Muskel des Uterus entfernt. Die Embryo-Implantationsstellen der meisten schwangeren Knockout-Tiere waren fehllokalisiert, lagen zu dicht oder waren in der Anzahl reduziert. Zudem war die Entwicklung des Uterus zu Beginn der Schwangerschaft bei Knockout-Mäusen verzögert. Angiogenese, die bei der Embryo-Implantation eine wichtige Rolle spielt, war beeinträchtigt und die PDGF-B-Konzentration im Serum von schwangeren Knockout-Tieren war erhöht. Glatte Muskelzellen aus Knockout-Tieren zeigten nicht die erwartete Migration nach PDGF-B-Stimulation. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die verminderte Angiogenese durch einen Migrationsdefekt der glatten Muskelzellen zu dem Ort der Gefäßneubildung bedingt ist, so dass neu gebildete Blutgefäße nicht ausreichend stabilisiert werden konnten. Durch den Verlust der Titin-Kinase-Region wurde ebenfalls der Arachidonsäurestoffwechsel beeinträchtigt. Dies führte zu einer verminderten Konzentration des Metaboliten 12-HETE im Uterus während der Schwangerschaft. Unsere Ergebnisse zeigen, dass sich die Signaltransduktion der Titin-Kinase-Region via PDGF-B und 12-HETE auf die weibliche Fruchtbarkeit auswirkt, vermutlich durch die Beeinflussung von Angiogenese. Das Verständnis von regulatorischen Mechanismen der Angiogenese während der Embryo-Implantation wird neue therapeutische Maßnahmen für einige Arten von Implantationsdefekten und Fehlgeburten ermöglichen.
The muscle protein titin is with a molecular weight of up to 3700 kDa the largest protein discovered so far and after actin and myosin the third most abundant protein in vertebrate striated muscle. Titin integrates into the Z-disc and M-band spanning the half sarcomere and forms an elastic scaffold along the myofiber. Titin has been implied in signal transduction, mechanical stability, and maintenance of sarcomere structure in health and disease. While titin in striated muscle has been well studied, its function in smooth muscle remains unclear although smooth muscle titin has been described on transcript as well as on protein level. To study smooth muscle titin, we established a knockin mouse model, in which titin’s N-terminus was labeled using the fluorescence protein DsRed. Striated muscle analysis of titin-DsRed mice confirmed the integration of DsRed within titin at the Z/I-junction of the sarcomere. This modification did not cause any obvious phenotype such as altered viability, heart weight to body weight ratio, or integration of titin into the sarcomere. The use of the DsRed enables live cell imaging as well as DsRed detection and makes the knockin mouse a suitable tool to visualize smooth muscle titin. It is of interest to localize titin in uterus as we were able to address a functional role for smooth muscle titin in early pregnancy. Titin's M-band exons 1 and 2, which encode titin’s kinase region, were efficiently removed in uterine smooth muscle of a conditional knockout model using a cre-recombinase. The majority of pregnant knockout animals showed mislocalization and crowding as well as a reduced number of embryo implantation sites. Furthermore, knockout mice had a delayed uterine development in early pregnancy and impaired angiogenesis, which is a hallmark of embryo implantation. The increased PDGF-B serum levels in pregnant knockout animals and the migration failure of knockout smooth muscle cells in response to PDGF-B indicate that impaired angiogenesis is due to a defect in recruiting smooth muscle cells to the site of vessel formation so that newly formed blood vessels were not stabilized properly. Loss of titin’s kinase region also affected arachidonic acid metabolism leading to a reduction of its metabolite 12-HETE in pregnant uterus. Our results demonstrate that signaling of titin’s kinase region via PDGF-B and 12-HETE influences female fertility most likely by affecting angiogenesis. The increased knowledge of regulatory mechanisms of angiogenesis during implantation enables novel therapeutic advances for select forms of human implantation failure and recurrent spontaneous abortion.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-26805
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/3981
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3684
Exam Date: 21-May-2010
Issue Date: 5-Nov-2013
Date Available: 5-Nov-2013
DDC Class: 500 Naturwissenschaften und Mathematik
Subject(s): Angiogenese
Glatter Muskel
Implantation
Titin
Angiogenesis
Implantation
Smooth muscle
Titin
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