Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3722
Main Title: Möglichkeiten und Grenzen beim Einsatz von Indikatorviren zur Überwachung virusbelasteter Oberflächengewässer
Translated Title: Prospects and limits of indicator viruses for the monitoring of virus-contaminated surface waters
Author(s): Hartmann, Nils Marten
Advisor(s): Selinka, Hans-Christoph
Referee(s): Rotard, Wolfgang
Szewzyk, Ulrich
Selinka, Hans-Christoph
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Humanpathogene Viren, die durch unzureichend oder ungeklärtes Abwasser in die Umwelt gelangen,können ein Gesundheitsrisiko für die Bevölkerung darstellen. Da die derzeitig verwendeten Fäkalindikatoren keine Viren einschließen und ein anderes Verhalten als diese im Wasser zeigen, wird derzeit nach potentiellen Kandidaten unter den Viren gesucht, die eine Indikatorfunktion übernehmen könnten. Darüber hinaus werden verlässliche Nachweissysteme benötigt, um eine sinnvolle Risikobewertung gewährleisten zu können. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Konzentrierungsmethoden in Bezug auf die Wiederfindung von Viren aus künstlich kontaminierten und nativen Labor- und Umweltproben miteinander verglichen. Als Viren wurden hierbei humanpathogene Adenoviren und Noroviren sowie intestinale Bakteriophagen eingesetzt, die allesamt als mögliche Indikatorviren gelten. Die Ergebnisse der Analysen zeigen, dass die hierbei angewandte Monolithische Affinitätsfiltration eine vielversprechende Methode darstellt, mit der auch in großen Volumina gute Wiederfindungsraten erzielt werden könnten. Im Gegensatz zu traditionellen Methoden, wie der Glaswollefiltration und der Ultrazentrifugation, variierten die Ergebnisse mit dieser Methode jedoch noch stark, weswegen weitere Entwicklungsarbeit benötigt wird. Während Adeno- und Noroviren über eine quantitative Polymerasekettenreaktion (qPCR) nachgewiesen wurden, erfolgte die Quantifizierung der Phagen über den Nachweis von Plaques. Der Nachweis von Viren in Umweltproben kann jedoch durch inhibierende Stoffe verhindert werden und insbesondere qPCR-Systeme zeigen eine hohe Anfälligkeit gegenüber solchen Substanzen. Aus diesem Grund wurden Methoden untersucht, mit denen sich Inhibitoren aus Umweltproben entfernen lassen. Die Kombination einer Nukleinsäureextraktion mittels NucliSens Extraktionskit und MobiSpin Säulen ermöglichte einen Nachweis auch noch in Laborproben, die Huminsäurekonzentrationen von bis zu 400 ng/μl enthielten, während die Grenze der Bestimmbarkeit ohne Aufreinigungsschritte bei 4 ng/μl lag. Die Anwendung der MobiSpin Säulen erlaubte auch eine bessere Quantifizierbarkeit in inhibierenden Umweltproben. Die Qualität der qPCR-Ergebnisse wurde weiterhin mit verschiedenen Kontrollsystemen untersucht, die in der Arbeit vorgestellt und diskutiert werden. Daneben wurden Möglichkeiten zur Identifizierung von Virusserotypen in Umweltproben und ihrer Diversität mittels Restriktionsfragmentanalyse, Denaturierender Gradientengelelektrophorese und Schmelzkurvenanalytik untersucht. Soweit dies ermittelt werden konnte, wurden die Methoden der Denaturierenden Gradientengelelektrophorese und der Schmelzkurvenanalytik nicht zuvor für die Analyse von Adenoviren in Umweltproben beschrieben. Alle drei Methoden ließen eine Unterscheidung verschiedener Serotypen zu, die Schmelzkurvenanalytik war im Gegensatz zu den übrigen Methoden jedoch mit weit geringerem Aufwand durchführbar. Die Untersuchung von abwasserkontaminierten Proben deutete darauf hin, dass sich Serotyp hAdV41 von den bekannten humanpathogenen Adenovirus-Serotypen am besten als Indikator eignen würde, da er in allen Proben nachgewiesen wurde.
Human pathogenic viruses, released into the environment by insufficient or untreated sewage, may be a threat to public health. Current indicators for fecal pollution do not include viruses and their ability to survive outside their hosts and their properties differ from those of the viruses. Therefore, potential candidates, which could be used as viral indicators for sewage pollution are investigated around the world. Furthermore, reliable detection systems are needed, to ensure meaningful risk assessments. For this purpose, different concentration methods were tested and compared with regard to recovery rates of viruses in native and spiked laboratory and environmental samples. Human pathogenic adenoviruses and noroviruses as well as enteric bacteriophages were used for spike experiments. All of these were previously regarded as potential indicator viruses. Results show, that high recoveries can be received even from samples with large volumes, using the tested monolithic affinity filtration system. However, in contrast to traditional methods, like glass wool filtration and ultracentrifugation, results varied and further evaluation is required. While adenoviruses and noroviruses were quantified by quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR), quantification of phages was performed by plaque assays. Detection methods may be subject to inhibitory substances within environmental samples. In particular, quantitative real-time polymerase chain reactions are at risk to fail, when inhibitors are present. Methods were investigated in order to eliminate relevant substances from environmental samples. By combining a nucleic acid extraction using the NucliSens extraction kit with MobiSpin column purification, quantification was possible in laboratory samples containing up to 400 ng/μl of humic acids. Without further treatment reliable quantification was not possible above 4 ng/μl. Moreover, application of MobiSpin columns improved quantification limits in inhibited environmental samples. The quality of qPCR results was controlled by different systems, that are discussed in the course of this thesis. Investigation of virus serotypes in environmental samples was performed, using restriction fragment analysis, denaturing gradient gel electrophoresis and melting point analysis as tools. To the best of my knowledge, denaturing gradient gel electrophoresis and melting point analysis were never before used to analyze adenovirus diversities in environmental samples. Discrimination of different adenovirus serotypes was possible using all three systems, but in contrast to restriction fragment analysis and denaturing gradient gel electrophoresis, melting point analysis was less complex and time-consuming. Examination of sewage contaminated samples indicated, that serotype hAdV41 is probably the most suitable candidate of the known human pathogenic adenovirus serotypes. Its stability was comparable to other serotypes, but it was the only serotype detected in all samples.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus4-39276
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/4019
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3722
Exam Date: 20-Jun-2013
Issue Date: 30-Jul-2013
Date Available: 30-Jul-2013
DDC Class: 500 Naturwissenschaften und Mathematik
Subject(s): Adenovirus
Oberflächengewässer
Fäkalindikator
Umweltprobe
Inhibition
Adenovirus
surface water
fecal indicator
environmental sample
inhibition
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