Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3831
Main Title: Phylogenetic and functional analysis of microbial, biogas-producing communities during the hydrolysis of lignocellulosic biomass
Translated Title: Phylogenetische und funktionelle Analyse mikrobieller Gemeinschaften während des anaeroben Abbaus von lignocellulosehältiger Biomasse
Author(s): Hanreich, Angelika
Referee(s): Szewzyk, Ulrich
Grohmann, Elisabeth
Klocke, Michael
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Substrate, die für die Gewinnung von Bio-Kraftstoffen zweiter Generation eingesetzt werden, enthalten einen hohen Anteil an Lignocellulose. Unter anaeroben Bedingungen verläuft der Abbau der Lignocellulose langsam und unvollständig. Die genaue Bestimmung der Zusammensetzung der am Abbau beteiligten, mikrobiellen Gemeinschaften sowie die Charakterisierung ihrer aktiven Stoffwechselwege sind notwendig, um die Biogasproduktion aus lignocellulosehältigen Substraten gezielt optimieren zu können. In dieser Studie wurden solche Biozönosen auf phylogenetischem und funktionellem Niveau untersucht. Es wurden Metagenomanalysen von mikrobiellen Gemeinschaften durchgeführt, die Stroh und Heu bei 38°C im einstufigen System verwerteten. Des Weiteren wurde das Metagenom mikrobieller Gemeinschaften in Hydrolysereaktoren zweier zweiphasiger Anlagen analysiert, die entweder bei 38°C oder bei 55°C betrieben wurden. Die Untersuchungen zeigten, dass in mesophilen Systemen Bacteroidetes für den Abbau von pflanzlicher Biomasse von großer Bedeutung waren. Firmicutes, die in allen untersuchten Reaktoren dominant vorlagen, wurden bei erhöhter Temperatur weiter angereichert. Methanogene Archaea wurden zu geringen Anteilen nachgewiesen. In einer weiteren zweiphasigen Pilotanlage, in der Stroh und Heu ebenfalls als Substrate eingesetzt wurden, wurde die Biodiversität der mikrobiellen Gemeinschaft durch Klonierung und Sequenzierungen des bakteriellen rrs Gens und durch T-RFLP Analysen bestimmt. Die Untersuchungen zeigten, dass die mikrobielle Gemeinschaft weder durch den Zusatz einer selektierten, hydrolytischen Reinkultur noch durch die Zugabe eines pilzlichen Enzympräparates stark beeinflussen wurde. In der Prozeßflüssigkeit wurden Vertreter der Thermodesulfobacteriaceae als dominante Gruppe nachgewiesen, während Clostridiaceae auf dem Gärrest detektiert wurden. Diese Verteilung ließ auf die unterschiedlichen Rollen dieser Gruppen während des Substratabbaus schließen. Um die mikrobiellen Gemeinschaften auf funktionellem Niveau zu untersuchen, wurden Metaproteomanalysen durchgeführt. Dazu wurde eine geeignete Methoden zur Konzentrationsbestimmung der isolierten Proteine eingeführt und ihre Auftrennung in der 2D-Gelelektrophorese verbessert. Vergleiche der Proteinmuster verschiedener Proben zeigten Veränderungen auf funktioneller Ebene an, die als Folge von Temperaturerhöhung oder wegen der Trennung von Stoffwechselwegen in verschiedene Reaktorstufen eintraten. Dominante Proteine wurden mittels Massenspektrometrie charakterisiert. Dabei wurden Schlüsselenzyme der Methanogenese in allen analysierten Reaktoren nachgewiesen. Es wurden zudem vereinzelt hydrolytische Enzyme, sowie mehrere Zuckertransporter detektiert. Zusammenfassend erwies sich der zweiphasige Ansatz zur Analyse mikrobieller Gemeinschaften in Biogasfermentationen als vorteilhaft. Durch die Kombination von phylogenetischer und funktioneller Charakterisierung konnte beispielsweise die metabolische Aktivität der methanogenen Archaea besser bestimmt werden. Diese ersten Erkenntnisse könnten entscheidend für die Entwicklung funktioneller Biomarkern sein.
Substrates for the production of second-generation biofuels usually contain high amounts of lignocellulosic biomass. The degradation of such recalcitrant material is a rate-limiting step during anaerobic digestion and biogas formation. In order to enhance this technology, more information about the underlying metabolic processes is required. Hence, microbial communities were studied on the phylogenetic and functional level in one- and two-phase biogas reactors. Metagenome analyses were performed on microbial communities digesting straw and hay in batch fermentations as well as in hydrolysis reactors, which were operated at 38°C or 55°C. It was revealed that Bacteroidetes played a major role in plant biomass degradation in the mesophilic set-up. Firmicutes were dominant in all analyzed systems and they were significantly enriched at higher temperatures. Archaea were detected in low percentages. The bacterial diversity of a two-phase pilot-scale reactor, which was constructed for the digestion of straw and hay, was examined by cloning and sequencing of rrs amplicons and T-RFLP fingerprinting analysis. These analyses revealed that the community composition was neither severely influenced by the addition of a selected, hydrolytic culture, nor by the addition of a fungal enzyme preparation. Generally, members of the Thermodesulfobacteriaceae were detected dominantly in the reactor fluid, whereas members of the Clostridiaceae were found attached to the fibers. This indicated their different roles during carbohydrate degradation. In order to gain insights into ongoing metabolic actions in hydrolytic and biogas-producing, microbial communities, protocols for the isolation of protein fractions by phenol extraction and for the determination of protein concentrations by the amido black assay were estab- lished. Two-dimensional gel electrophoresis was performed to separate protein fractions and to visualize the highest abundant proteins. It was shown that spot separation was severely ameliorated, if paper-bridge loading was applied. By the comparison of protein spot patterns, changes in communities on the functional level were detected. These were most likely induced by temperature elevation and by physical separation of hydrolysis and methanogenesis in two-phase reactors. Further, several dominant proteins were identified by tandem mass spectrometry. Interestingly, key enzymes of methanogenesis were strongly expressed in all analyzed systems, i.e. in mesophilic batch tests, in a thermophilic, continuously stirred tank reactor, and also in the hydrolysis stage of a pilot-scale reactor operated at 45°C. Few hydrolytic enzymes were detected, but sugar transporters expressed by members of the Bacteroidetes were identified. In summary, the application of a biphasic approach, i.e. the parallel assessment of the phylogenetic and the functional state of microbial communities, was advantageous as, e.g., the metabolic activity of methanogens was clearly revealed. Further, the utilization of metagenomic datasets increased the number of identifications during the characterization of microbial metaproteomes. These initial metaproteomic studiesmay give rise to the development of new biomarkers, which could directly target the key enzymes of the process.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus4-42338
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/4128
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3831
Exam Date: 19-Sep-2013
Issue Date: 16-Oct-2013
Date Available: 16-Oct-2013
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): Biogas
Lignocellulose
Metagenom
Metaproteom
Mikrobielle Gemeinschaften
Biogas
Lignocellulose
Metagenomics
Metaproteomics
Microbial communities
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