Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3917
Main Title: Entwicklung eines Schnelldetektionssystems zum Nachweis von Orthopockenviren
Translated Title: Development of a rapid detection system for orthopoxviruses
Author(s): Stern, Daniel
Advisor(s): Nitsche, Andreas
Referee(s): Lauster, Roland
Nitsche, Andreas
Kurreck, Jens
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Die Famile der Orthopockenviren umschließt neben den zwar ausgerotteten, im Falle einer nicht auszuschließenden bioterroristischen Ausbringung aber hochgefährlichen Variolaviren weitere humanpathogene Viren wie das Affenpocken-, das Kuhpockensowie das Vacciniavirus. Als zoonotische Erreger endemisch in Zentral- und Westafrika, Europa sowie Südamerika, verursachen Sie lokal begrenzt bis systemisch verlaufende pustuläre Erkrankungen, welche in Einzelfällen bis zum Tod führen können. Aufgrund des seltenen Auftretens sind deutschlandweit nur wenige Speziallabore wie das Robert Koch-Institut in der Lage, den Nachweis einer Orthopockenvirusinfektion anhand serologischer, Nukleinsäure- oder Partikel-basierter Nachweisverfahren zu erbringen. Ein im Falle einer bioterroristischen Freisetzung von Variolaviren notwendiges schnelles, sensitives und einfach durchzuführendes Detektionssystem existiert bis heute jedoch nicht. Um diese Lücke zu schließen, war das Ziel dieser Arbeit die Entwicklung eines Antikörper-basierten Schnelldetektionssystems zum Nachweis von Orthopockenviren. Durch Testung Oberflächenprotein-spezifischer polyklonaler Antikörper konnte gezeigt werden, dass das Attachment-Protein A27 am geeignetsten zur Induktion Detektions- optimierter Antikörper ist. In einem mehrstufigen Screeningverfahren wurden daher monoklonale Antikörper gegen A27 generiert, deren Bindungsepitope und Bindungskinetik mittels Peptid-Epitopmapping und Oberflächenplasmonresonanz- Messung bestimmt wurden. Hierbei zeigte sich, dass gute Zugänglichkeit der Bindungsepitope sowie schnelle und multivalente Bindung entscheidend für Detektionsoptimierte Antikörper waren. Die beiden besten Antikörper wurden schließlich auf der Abicap Vor-Ort-Detektionsplattform implementiert und bezüglich Sensitivität und Spezifität beim Orthopockenvirusnachweis charakterisiert. Als Ansatzpunkt für potenzielle Weiterentwicklungen wurden diese zusätzlich in Form rekombinanter single chain fragment variable Antikörper exprimiert und getestet. Das etablierte Detektionssystem war in der Lage, alle getesteten humanpathogenen Orthopockenviren mit hoher Sensitivität von bis zu 1,75×10^2 PFU/ml in 45 Minuten zu detektieren, wobei der Nachweis aus klinischem Material sowie einem verblindetem Probenpanel ohne Kreuzreaktivitäten möglich war. Durch die schnelle und einfache Durchführbarkeit bei gleichzeitig hoher Sensitivität eignet sich das Abicap-System sehr gut für die Vor-Ort-Testung sowohl bioterroristischer als auch klinischer Proben. Darüber hinaus können die in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse zur Generierung Detektions-optimierter Antikörper auf anderer Erreger übertragen werden.
Besides the eradicated Variola virus, which in the case of an unlikely but non excludable bioterrorist attack nevertheless remains highly dangerous, the Orthopoxvirus family contains further viruses pathogenic for humans like Monkeypox, Cowpox, and Vaccinia virus. As zoonotic agents, they are endemic in Central and Western Africa, Europe, and South America, causing mainly local to systemic pustular diseases which, in rare cases, can lead to death. Due to their rare incidence, only a few specialized laboratories like the Robert Koch-Institute are able to diagnose orthopoxvirus infections via serological, nucleic acid, or virus-particle based detection methods. However, to date there is no fast, sensitive and simple rapid on-site detection system, which in the case of bioterrorist release of Variola virus would be needed. To fill this gap, the aim of this work was to develop an antibody-based rapid detection system for Orthopoxviruses. By testing surface protein-specific polyclonal antibodies, we could show that the attachment protein A27 is most suited for induction of detection-optimized antibodies. Hence, a multi-level screening was used to generate A27-specific monoclonal antibodies whose binding epitopes and kinetics were determined by peptide epitope mapping and surface plason resonance measurement. Hereby, high accessibility of binding epitopes as well as rapid and multivalent binding were hallmarks for detection-optimized antibodies. Finally, two outperforming antibodies were implemented on the Abicap onsite detection platform and characterized regarding their sensitivity and specificity in Orthopoxvirus detection. Additionally, as a starting point for further optimization, both antibodies were expressed as recombinant single-chain variable fragments. The established rapid detection system was able to detect all tested Orthopoxviruses pathogenic to humans with high sensitivity down to 1.75×10^2 PFU/ml within 45 minutes. Detection was possible from clinical samples and a blinded sample panel without cross-reactivity. Due to rapid and simple handling at sustained high sensitivity, the Abicap-platform is highly suited for onsite testing in a bioterrorist as well as a clinical context. Furthermore, findings regarding the generation of detectionoptimized antibodies gained during this work could be transferred to other agents.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus4-46273
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/4214
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3917
Exam Date: 1-Nov-2013
Issue Date: 4-Mar-2014
Date Available: 4-Mar-2014
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
610 Medizin und Gesundheit
Subject(s): A27
ABICAP
Monoklonale Antikörper
Orthopockenviren
Schnelldetektion
Monoclonal antibodies
Orthopoxvirus
Rapid detection
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Appears in Collections:Technische Universität Berlin » Fakultäten & Zentralinstitute » Fakultät 3 Prozesswissenschaften » Institut für Biotechnologie » Publications

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