Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3926
Main Title: Studien zur α- und β-Hydroxylierung des Cyclodepsipeptides Skyllamycin aus Streptomyces sp. Acta 2897
Translated Title: Studies on the α- and β-Hydroxylation of the Cyclodepsipeptide Skyllamycin from Streptomyces sp. Acta 2897
Author(s): Uhlmann, Stefanie
Advisor(s): Süßmuth, Roderich
Referee(s): Süßmuth, Roderich
Marahiel, Mohamed
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Bakterien und Pilze produzieren eine große Vielfalt an Naturstoffen, die vom Menschen für viele verschiedene Zwecke genutzt werden können. Die meisten dieser Sekundärmetaboliten werden durch nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) oder Polyketid-Synthetasen (PKS) generiert und durch weitere modifizierende Enzyme (sogenannte Tailoring-Enzyme) strukturell verändert. Die Totalsynthese solcher Naturstoffe ist häufig kompliziert und sehr kostenintensiv, darüber hinaus ist für die industrielle Anwendung oft eine Derivatisierung der ursprünglichen Struktur sinnvoll und notwendig. Zur biotechnologischen, semisynthetischen oder chemoenzymatischen Darstellung dieser Naturstoffe oder deren Derivate ist das detaillierte Wissen über deren Biosynthese und die Mechanismen der beteiligten Enzyme unerlässlich. In dieser Arbeit wurde die Einführung der Hydroxylierungen in die Struktur des Skyllamycins, einem Naturstoff aus Streptomyces sp. Acta 2897 untersucht. Skyllamycin ist ein nichtribosomal synthetisiertes Cyclodepsipeptid bestehend aus 11 Aminosäuren mit mehreren ungewöhnlichen Strukturmerkmalen. Neben der α -ydroxylierung von Glycin an Position 9 (Gly9) und den drei β-Hydroxylierungen an L-Phe5, L-Tyr7 und D-Leu11 trägt L-Asp7 eine β-Methylierung und L-Tyr7 ist zusätzlich O-methyliert. Schließlich ist die erste Aminosäure Threonin mit einem ungewöhnlichen 2-[1‘-Z-Propenyl]-Zimtsäurerest am N-Terminus verknüpft. Die α-Hydroxylierung von Glycin wird von einer flavinabhängigen Monooxygenase (SkyMono) und der zugehörigen Flavin-Reduktase (SkyRed) eingeführt. Die beiden Enzyme wurden heterolog in Escherichia coli exprimiert und aufgereinigt und anschließend spektroskopisch und strukturell charakterisiert. Die Untersuchungen ergaben, dass SkyRed als Homodimer vorliegt und die Reduktion von FMN und FAD unter NADH-Verbrauch katalysiert. Dabei wird ein schwacher SkyRed Flavinred:::NAD+-charge transfer-Komplex ausgebildet. Die Bindung des Flavins erfolgt dabei lediglich über den Isoalloxazinring des Flavins. Die Monooxygenase liegt ebenfalls als Homodimer vor und bindet reduziertes FAD mit einem KD-Wert von 128 ± 28 nM. Die β-Hydroxylierungen von L-Phe5, L-Tyr7 und D-Leu11 werden von einer Cytochrom P450-Monooxygenase (P450sky) eingeführt. Durch in vitro-Studien konnte gezeigt werden, dass P450sky diese Hydroxylierung einführt, während die Aminosäuren an den entsprechenden PCP-Domänen der Skyllamycin-Synthetase gebunden sind. P450sky akzeptiert nur PCP-gebundene Substrate, arbeitet in Interaktion mit der NRPS und differenziert zudem zwischen den drei Substrat-PCP-Domänen und anderen Nicht-Substrat-PCP-Domänen der NRPS. Dies unterscheidet P450sky von den bekannten β-hydroxylierenden P450-Monooxygenasen und deren Wirkungsweise an externen AT-Modulen. Darüber hinaus konnte die Kristallstruktur von P450sky bis zu einer Auflösung von 1,9 Å gelöst werden. Diese Ergebnisse zeigen einen neuen Weg der Hydroxylierung von Naturstoffen auf und erweitern damit das Wissen über die Komplexizität von nichtribosomalen Peptidsynthetasen.
Bacteria and fungi produce a great variety of natural compounds, which can be utilized for many different purposes. Most of these secondary metabolites are generated by nonribosomal peptide synthases (NRPS) or polyketide synthases (PKS) and are further structurally modified by tailoring enzymes. The total synthesis of such compounds is often complicated and cost-intensive. Moreover, in many cases a derivatization of the original structure is reasonable, if not necessary for the industrial application. For biotechnological, semisynthetic or chemoenzymatic production of these compounds or its derivatives, it is therefore essential to have a profound knowledge of the involved enzymes. In this work, the introduction of the hydroxylations in the structure of skyllamycin, a natural compound from Streptomyces sp. Acta 2897 is investigated. Skyllamycin is a nonribosomally synthesized cyclodepsipeptide consisting of 11 amino acids with several unusual structural features. In addition to the α-hydroxylation of glycine at position 9 (Gly9) and the three β-hydroxylations at L Phe5, L Tyr7 and D Leu11, there is a β-methylation at L Asp7 and a O methylation at L Tyr7. Furthermore, the first amino acid threonine is linked to an unusual 2-[1‘-Z-propenyl]-cinnamoyl moiety at the N-terminus. The α-hydroxylation of glycine is introduced by a flavin-dependent monooxygenase (SkyMono) and its corresponding flavin reductase (SkyRed). These two enzymes were heterologously expressed in Escherichia coli and purified and subsequently characterized spectroscopically and structurally. The studies revealed that SkyRed exists as a homodimer and catalyzes the reduction of FMN and FAD under consumption of NADH. During the reaction, a weak SkyRed Flavinred:::NAD+ charge transfer complex is formed. The binding of the flavin to the enzyme is accomplished solely through the isoalloxazine ring of the flavin. The monooxygenase also exists as a homodimer and binds reduced FAD with a KD value of 128 ± 28 nM. The β-hydroxylations of L Phe5, L Tyr7 und D Leu11 are introduced by a cytochrome P450 monooxygenase (P450sky). By means of in vitro studies it could be shown that P450sky catalyzes the hydroxylation while the amino acids are bound to the corresponding PCP domains of the skyllamycin synthetase. P450sky only accepts PCP-bound substrates, interacts with the NRPS and differentiates between the three substrate PCP domains and other non-substrate PCP domains. This distinguishes P450sky from other known β-hydroxylating P450 monooxygenases and their mode of action on external AT modules. Furthermore, the crystal structure of P450sky could be solved to a resolution of 1.9 Å. These results show a new mode of hydroxylation of natural compounds and expands the knowledge about the complexity of nonribosomal peptide synthetases.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus4-46558
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/4223
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3926
Exam Date: 25-Nov-2013
Issue Date: 11-Dec-2014
Date Available: 11-Dec-2014
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): Cytochrom P450-Monooxygenase
Hydroxylierung
Naturstoff
NRPS
Skyllamycin
Hydroxylation
Natural compound
Nonribosomal peptide synthesis
Usage rights: Terms of German Copyright Law
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