Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3955
Main Title: Direct comparison of T cell receptor avidity of auto-antigen specific conventional and regulatory T cells
Translated Title: Direkter Vergleich von T-Zell-Rezeptor Avidität der Auto-Antigen-spezifischen konventionellen und regulatorischen T-Zellen
Author(s): Stervbo-Kristensen, Ulrik
Advisor(s): Fillatreau, Simon
Referee(s): Fillatreau, Simon
Lauster, Roland
Neubauer, Peter
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Eine der wichtigsten Eigenschaften des Immunsystems ist seine Fähigkeit, körpereigenes Selbst von pathogenem Nicht-Selbst zu unterscheiden. Ein Versagen der Selbsttoleranz kann zu Autoimmunerkrankungen wie Multipler Sklerose oder Typ I Diabetes führen. Natürlich vorkommende regulatorische T-Zellen (Tregs) sind wesentlich an der Aufrechterhaltung der Selbsttoleranz beteiligt. Somit bieten Treg-basierte Therapien einen vielversprechenden Ansatz zur Wiederherstellung der Selbsttoleranz in Autoimmunerkrankungen, der möglicherweise sogar zu einer vollständigen Heilung führen könnte. Es wird davon ausgegangen, dass Tregs T Zell Rezeptoren (TCR) exprimieren, die eine hohe Avidität gegenüber Selbst-Antigenen aufweisen. Für die Verwirklichung von Treg-basierten Therapien wäre die Generierung von Tregs mit definierten TCRs von entscheidender Bedeutung. Außerdem könnten konventionelle CD4+ T Zellen, die mit spezifischen Treg TCRs ausgestattet werden, anti-Tumor Reaktionen unterstützen. Da die hohe Avidität von Treg TCR bislang nur für Antigene nachgewiesen wurde, die nicht natürlich vorkommen, steht der Nachweis hoher Avidität von Treg TCRs gegenüber Selbstantigenen im physiologischen Kontext noch aus. Das Ziel dieser Arbeit war der Vergleich der TCR Avidität von Tregs und Nicht-Tregs gegenüber einem natürlichen Selbst-Antigen. Ein neu erzeugter Mausstamm, der eine Myelin-oligodendrozyten Glykoprotein (MOG)-spezifische TCRb-Kette und eine endogene TCRa exprimiert, wurde mit einem Foxp3 Reporterstamm gekreuzt. Tregs und Nicht-Tregs wurden aus den periphären lymphoiden Organen von unbehandelten Mäusen sowie aus dem zentralen Nervensystem (ZNS) von MOG35-55 immunisierten Mäusen isoliert. Nach Amplifikation und Sequenzierung wurden die TCRa-Ketten eingehenden bioinformatischen Analysen unterzogen, um Sequenzmuster zu identifizieren und Strategien für die Auswahl von TCRs für vergleichende Experimente zu entwickeln. Eine methode zu beurteilung die Sequenzierungsgenauigkeit war entwickelt. Ausgewählte TCRa-Ketten wurden in TCR defizienten Reporterzelllinien zusammen mit einer MOG-spezifischen TCRb-Kette exprimiert. Die Avidität der auf diese Weise generierten TZRs wurde durch Stimulation der Zellen mit MOG35-55 untersucht. % Ein neu erzeugter Mausstamm, der eine Myelin-oligodendrozyten Glykoprotein (MOG)-spezifische TCRb-Kette und eine endogene TCRa exprimiert, wurde mit einem Foxp3 Reporterstamm gekreuzt. Tregs und Nicht-Tregs wurden aus den periphären lymphoiden Organen von unbehandelten Mäusen sowie aus dem zentralen Nervensystem (ZNS) von MOG35-55 immunisierten Mäusen isoliert. Nach Amplifikation und Sequenzierung wurden die TCRa-Ketten eingehenden bioinformatischen Analysen unterzogen, um die Sequenzierungsgenauigkeit zu beurteilen, Sequenzmuster zu identifizieren und Strategien für die Auswahl von TCRs für vergleichende Experimente zu entwickeln. Ausgewählte TCRa-Ketten wurden in TCR defizienten Reporterzelllinien zusammen mit einer MOG-spezifischen TCRb-Kette exprimiert. Die Avidität der auf diese Weise generierten TZRs wurde durch Stimulation der Zellen mit MOG35-55 untersucht. Aus den vier Zellpopulationen wurden insgesamt 9968 Sequenzen erhalten. Die Zahl der Sequenzen war unter den analysierten Zellpopulationen nahezu gleichverteilt. Es wurde abgeschätzt, dass 0.3% der vom CDR3 abgeleiteten Aminosäuresequenzen sich von der wahren Sequenz unterscheiden. Es konnte kein Muster identifiziert werden, anhand dessen Tregs von Nicht-Tregs zu unterscheiden wären. In einem zweiten Schritt wurden Zelllinien mit TCRa-Ketten generiert, die aus der Schnittmenge verschiedener Experimente ausgewählt wurden. Antigenspezifische TCRs von ZNS Tregs zeigten eine signifikant höhere Avidität als TCRs von ZNS infiltrierenden Nicht-Tregs. Anhand des TCRa Sequenzmusters konnte keine Unterscheidung von Tregs und Nicht-Tregs vorgenommen werden. Dennoch bestätigen funktionelle Assays eine höhere Avidität von Treg TCRs im Vergleich zu Nicht-Tregs TCRs gegenüber dem endogenen Selbst-Antigen MOG35-55.
A cardinal feature of the immune system is its self-tolerance that stems from discriminating self from pathogenic non-self. Breakdown of this self-tolerance may lead to autoimmune reactions and development of diseases such as MS and type I diabetes. Naturally occurring Tregs are essential promoters of self-tolerance. This makes Treg-based therapies promising approaches to alleviate and potentially cure autoimmune disorders. Tregs express TCRs, believed to be specific to self-antigens with high avidity. An aspiration of Treg-based therapies is to engineer Tregs to express particular TCRs. Additionally, anti-tumour immunology may be improved by engineering conventional CD4+ T cells to express particular Treg derived TCRs. However, as the high avidity of the Treg TCR has only been demonstrated with antigens not naturally occurring, this property of the Treg TCR has not been formally demonstrated in a physiological context. The aim of this work was to compare the TCR avidity of Tregs and non-Tregs against a naturally occurring self-antigen. A newly generated mouse strain, expressing a TCRb-chain specific for the murine auto-antigen MOG and endogenous TCRa-chain, was crossed to a Foxp3-reporter strain. Tregs and non-Tregs were isolated from the CNS and the periphery of MOG35-55 immunised and naive mice. TCRa-chains were sequenced and subjected to rigorous bioinformatical analysis to evaluate sequence patterns and other strategies to choose representative TCRs for direct comparison. Sequence accuracy was assessed by a purpose developed method. Selected TCRa-chains were re-expressed in a TCR deficient reporter cell line and avidity was then assessed directly by stimulation of the generated cells with MOG35-55. A total of 9968 sequences were obtained from the four cell populations. The number of sequences were nearly equally distributed among the analysed cell populations. 0.3% of the deduced TCR amino acid sequences were estimated to differ from the true sequence. No pattern was found to discriminate Tregs from non-Tregs. Cell lines were consequently generated with TCRa-chains selected from intersections between different experiments. Antigen specific TCRs from CNS Treg showed significantly higher avidity than TCRs from CNS infiltrating non-Treg. No TCRa sequence patterns distinguished Tregs from non-Tregs. Tregs expressed TCRs of higher avidity towards the stimulating antigen than non-Tregs.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus4-47471
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/4252
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3955
Exam Date: 7-Feb-2014
Issue Date: 19-Feb-2014
Date Available: 19-Feb-2014
DDC Class: 500 Naturwissenschaften und Mathematik
Subject(s): Avidität
Nicht regulatorische T-Zellen
Regulatorische T-Zellen
T-Zellen-Rezeptoren
Tregs
Avidity
Non-Tregs
T cell receptors
Tregs
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