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Main Title: RNA-Interferenz- und Rezeptor-basierte Kombinationstherapie zur Inhibierung von Coxsackievirus B3
Translated Title: RNA interference- and receptor-based combination therapy for inhibition of Coxsackievirus B3
Author(s): Stein, Agnes Elisabeth
Advisor(s): Kurreck, Jens
Referee(s): Kurreck, Jens
Bock, Claus-Thomas
Lauster, Roland
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Akute Myokarditiserkrankungen im Menschen stellen ein schwerwiegendes Problem in der Klinik dar und sind eine der Hauptursachen für Herzinsuffizienz. Die sich aus ihnen entwickelnden chronischen Formen bis hin zur DCM können zu Herzversagen und der Notwendigkeit einer Herztransplantation führen. Myokarditiden können durch eine Vielzahl infektiöser Erreger ausgelöst werden, wobei Enteroviren, insbesondere Coxsackievirus B3, einen hohen Anteil ausmachen. Da die Behandlung CVB3-bedingter Myokarditiserkrankungen in der Klinik größtenteils symptomatisch erfolgt, besteht ein großer Bedarf an der Entwicklung neuer, virusspezifischer Behandlungsoptionen. Die vorliegende Arbeit beschreibt das antivirale Potential einer Anti-CVB3-Kombinationstherapie, bestehend aus einer löslichen Rezeptorvariante sCAR-Fc und Anti-CVB3-shRNAs, shRdRP2 und shRdRP4. Die Expression der Substanzen erfolgte dabei ausschließlich über virale Vektoren. 1. Sowohl sCAR-Fc als auch shRdRP2.4 waren in Zellkultur in der Lage, die CVB3-Replikation effektiv zu inhibieren. Dies zeigte sich in der Verminderung des Virustiters und einer Erhöhung der Zellviabilität. 2. Bei gleichzeitigem Einsatz beider Komponenten in vitro konnte ein additiver antiviraler Effekt beobachtet werden, der eine signifikante Steigerung gegenüber den Einzeltherapien aufwies. Der antivirale Effekt war ferner abhängig von der Dosis der eingesetzten Komponenten, was die Spezifität des additiven Effekts belegt. 3. Auch in einem akuten in vivo CVB3-Maus-Myokarditismodell zeigte sich das antivirale Potential von therapeutisch eingesetztem sCAR-Fc und prophylaktisch verabreichten shRdRP2 und 4. Beide Substanzen waren bei individuellem Einsatz in der Lage das Inflammationslevel des Herzens sowie die Viruslast im Myokard signifikant zu verringern. Ferner verbesserten sie die hämodynamischen Parameter signifikant. 4. Der in vitro beobachtete, additive antivirale Effekt bei gleichzeitigem Einsatz von sCAR-Fc und shRdRP2.4, wurde auch in vivo deutlich. So wiesen die zweifach behandelten Tiere, im Vergleich zu den einzeltherapierten, signifikant niedrigere Virustiter und Inflammationslevel im Herzen auf. Auch ihre Herzfunktionsparameter, als wichtigste Kriterien für den Erfolg einer antiviralen Therapie gegen CVB3, waren signifikant besser, als die der einzeltherapierten. 5. Die in vivo erzielten Ergebnisse der Kombinationstherapie wiesen eine äußerst starke Konsistenz auf. So konnte nach Behandlung mit AdG12 und Dox bzw. mit scAAV2/9-shRdRP2.4 die jeweils wirksame Komponente sCAR-Fc bzw. shRdRP2.4 erfolgreich nachgewiesen werden. Durch diese verringerten sich die Virustiter im Herzen signifikant, was zu einer schwächeren Immunreaktion auf das Virus mit verringerter Inflammation und letztlich zu einer verbesserten Herzfunktion führte. 6. Nebenwirkungen oder antagonistische Effekte bei gleichzeitigem Einsatz beider antiviraler Komponenten wurden weder in vitro noch in vivo beobachtet. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation veranschaulichen das große Potential von Kombinationstherapien bei der Behandlung viraler Erkrankungen. Die Strategie, Viren an verschiedenen Stellen ihres Replikationszyklus anzugreifen und somit stärker zu inhibieren, ist dabei nicht nur für CVB3-Infektionen anwendbar, sondern kann generell auf alle Viren übertragen werden. Insbesondere bei schnell mutierenden Viren kann dadurch außerdem die Entstehung von Escape-Mutanten verhindert werden. Die Kombination zweier verschiedener Wirkstoffe stellt dabei nur den ersten Schritt einer Kombinationstherapie dar und kann in Zukunft je nach Komplexität und Virulenz des Virus um weitere Komponenten erweitert werden.
Acute myocarditis in humans is a major issue in the clinic and one of the main causes for heart insufficiency. Chronic myocarditis and dilated cadiomyopathy can develop upon acute myocarditis and lead to heart failure and the necessity for heart transplantation. Myocarditis can be caused by a wide variety of infectious agents, with enteroviruses and especially CVB3 being the most prevalent. Since the treatment of CVB3 caused myocarditis is mostly symptomatic, there is a big need for the development of new, virus-specific treatment options. The present study describes the antiviral potential of an anti-CVB3 combination therapy consisting of a soluble receptor variant, called sCAR-Fc, and anti-CVB3 shRNAs, namely shRdRP2.4. For the expression of both components, viral vectors were employed. 1. In vitro, both sCAR-Fc and shRdRP2.4 were capable of inhibiting CVB3 replication effectively. This was shown by the reduction of virus titer as well as the enhancement of cell viability. 2. When combining both components in vitro, an additive antiviral effect was observed. The enhancement of the antiviral potency was significant compared to the individual effects of sCAR-Fc and shRdRP2.4. Furthermore the antiviral effect was dose-dependent, proving its specificity. 3. In an acute in vivo CVB3 mouse myocarditis model, the antiviral potential of therapeutically applied sCAR-Fc and prophylactically applied shRdRP2.4 was also confirmed. When individually applying each of the components, the inflammation level and virus titer in the heart were significantly reduced. Furthermore, the hemodynamic parameters of the animals were also improved significantly. 4. The additive antiviral effect, which was observed in vitro when applying sCAR-Fc and shRdRP2.4 simultaneously, also became apparent in vivo. Combined treated mice showed significantly less inflammation and lower virus titers in the heart compared to each of the individually treated groups. Also their heart parameters, as the most important criteria for the success of an antiviral treatment against CVB3, were significantly improved compared to single treatment. 5. The results of the in vivo approach show a remarkable consistency. After treatment with AdG12 and Dox or scAAV2/9-shRdRP2.4 respectively, the antiviral agents sCAR-Fc and shRdRP2.4 were present in the animals, leading to a significant decrease of the virus titer in the heart. Therefore the immune reaction towards the virus was strongly reduced as shown by a reduced level of inflammation in the heart. Consequently the heart function in treated animals was significantly improved compared to virus-infected, untreated mice. 6.No side effects or antagonistic effects were observed following combined application of sCAR-Fc and shRdRP2.4 both in vitro and in vivo. The results of the present study prove the great potential of combination therapies for the treatment of viral diseases. The strategy to target viruses at distinct points of their replication cycle to gain higher antiviral efficacy, is not only applicable for CVB3 infections but can also be transferred to virus infections in general. Another major advantage of combination treatment is the prevention of escape mutants especially in fast mutating viruses. The combination of two active components is only the first possible step of a combined therapy and can be extended in the future depending on virus complexity and virulence.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus4-48072
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/4268
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-3971
Exam Date: 21-Feb-2014
Issue Date: 4-Mar-2014
Date Available: 4-Mar-2014
DDC Class: 500 Naturwissenschaften und Mathematik
570 Biowissenschaften; Biologie
610 Medizin und Gesundheit
Subject(s): Gentherapie
Kombinationstherapie
Myokarditis
RNA-Interferenz
Virus
Combination therapy
Gene therapy
Myocarditis
RNA interference
Virus
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