Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4025
Main Title: The influence of an amino acid permease on diacetyl production during beer fermentation
Translated Title: Der Einfluss einer Aminosäure-Permease auf Diacetyl-Produktion während der Biergärung
Author(s): James, Nisha
Advisor(s): Stahl, Ulf
Referee(s): Lang, Christine
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, durch gezielte genetische Modifikationen (metabolic engineering) die Diacetylwerte in Brauhefestämmen zu reduzieren und dadurch die Lagerungsdauer signifikant zu verkürzen. Die Gentargets (GOI) für eine verringerte Diacetylproduktion wurden mittels Microarray-basierter Transkriptomanalyse von sechs unterschiedlichen Brauhefestämmen (Lagerbier) mit jeweils abweichenden Diacetylwerten ermittelt. Aus den umfangreichen Daten der Transkriptionsanalyse konnte GAP1 (General Amino acid Permease) aufgrund unterschiedlicher Expressionsmuster während des Brauprozesses als potentieller Kandidat identifiziert werden. Ein weiterer Grund für die Auswahl war die Funktion von Gap1p als Transporter und Rezeptor (Transceptor) für Aminosäuren. Ausgehend von den Transkriptomdaten wurde die Hypothese aufgestellt, dass eine positive Korrelation zwischen der Menge von Gap1p, deren Aktivität sowie der Diacetylkonzentration besteht. Die Überprüfung der Hypothese der Diacetylproduktion wurde in Hefestämmen mit veränderten Gap1p-Expression analysiert. Hierfür wurden Δgap1 Deletionsmutanten als auch Mutanten mit einer erhöhten GAP1 Expression von S. cerevisiae (BY4741) erzeugt und mit dem Wildtyp verglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass die erhöhte Expression von GAP1 in Hefen tatsächlich zu signifikant gesteigerten Diacetylkonzentrationen führen. Darüber hinaus wurden unter Produktionsbedingungen Brauhefestämme (Transformant) mit erhöhter GAP1 Expression als auch deren Wildtyp untersucht (Stamm C, ein mittlerer Diacetylproduzent und Stamm F, ein niedriger Diacetylproduzent). Die Überexpression von GAP1 in den Brauhefestämmen C und F führt zum Anstieg der Diacetylproduktion. Weiter konnte in vier Wildtypstämmen (Stamm B, C, D, F) und zwei Transformanten (von Stamm C und F) mit verschiedenen Gap1p-Expressionsraten gezeigt werden, dass eine direkte Korrelation zwischen der Gap1p-Aktivität und der Produktion von Diacetyl existiert. Die Expression von Gap1p ist stark reduziert in der Anfangsphase des Brauprozesses, wenn hochwertige Stickstoffquellen im Überschuss verfügbar sind. Unter diesen Bedingungen ist die Aktivität von verzweigtkettigen Aminosäurepermeasen (z.B. Bap2p und Bap3p) erhöht. Wenn die hochwertigen Stickstoffverbindungen verbraucht sind, werden die spezifischen Aminosäurepermeasen reprimiert und Gap1p hochreguliert. Die erhöhte Aktivität von BAP resultiert in einer verstärkten Aufnahme von verzweigtkettigen Aminosäuren, was wiederum zu einer verminderten Diacetylproduktion führt. Es exsitieren viele verschiedene genetische Faktoren die Diaycetylproduktion zu beeinflussen. In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass einer dieser genetischen Faktoren GAP1 ist.
Inverse metabolic engineering approach was used to influence diacetyl levels in brewers’ yeast strains to reduce time needed for beer maturation. Gene targets for reducing diacetyl production were identified using microarray-based transcriptome analysis of six lager brewing yeast strains with differences in their diacetyl levels. GAP1 encoding for General Amino acid Permease was selected as a potential candidate in several genes that showed differential expression during beer fermentation process. Gap1p was also selected based on its function as a transporter and receptor (transceptors) for amino acids and its expression is highly regulated depending on the availability of amino acids in the medium. Based on the TDA results, a hypothesis was proposed that there is a positive correlation between amounts of Gap1p and diacetyl levels. The correlation seen in the Gap1p expression and activity among four lager yeast strains agreed with the transcriptome data results. For verification of the hypothesis diacetyl production in yeast strains were analysed under varying Gap1p levels. Diacetyl levels were examined in Δgap1 and in GAP1 overexpression strains of S. cerevisiae (BY4741) and compared to the wild type. Results indicate that increasing Gap1p levels in yeast indeed leads to significant increase in their diacetyl levels. Similarly, GAP1 overexpression in bottom fermenting yeast strains (Strain C, a medium diacetyl producer and Strain F, a low diacetyl producer) resulted in increased diacetyl levels compared to their respective wild-type strains. The correlation between Gap1p activity and diacetyl production in the respective brewing strains (4 wildtype and 2 transformants) were studied under brewing conditions and the results showed that higher levels of GAP1 in the strains gave rise to a corresponding increase their diacetyl production in all strains. Previous studies have shown that the uptake of branched-chain amino acids (BCAAs) like valine, leucine and isoleucine were better under GAP1 repressed conditions indicating that the branched chain amino acid permeases like Bap2p, Bap3p (transporters of BCAAs) are more active under lower levels of Gap1p. Such a condition enables better uptake of preferred nitrogen sources. Increase in valine uptake results in reduced diacetyl production due to feedback inhibition in the valine biosynthesis pathway. Among several genetic factors that cause variation in the diacetyl production in different brewing yeast strains, the variation in the rate of Gap1p expression is identified.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus4-50202
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/4322
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4025
Exam Date: 5-Dec-2013
Issue Date: 13-Nov-2014
Date Available: 13-Nov-2014
DDC Class: 500 Naturwissenschaften und Mathematik
572 Biochemie
Subject(s): Diacetyl
Genetik
Bier
Gärung
Diacetyl
genetics
beer
fermentation
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Appears in Collections:Technische Universität Berlin » Fakultäten & Zentralinstitute » Fakultät 3 Prozesswissenschaften » Institut für Biotechnologie » Publications

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