Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4142
Main Title: Untersuchungen zur Biosynthese des ungewöhnlich hydroxylierten zyklischen Depsipeptids RP-1776 aus Streptomyces sp. Acta 2897
Translated Title: Characterization of the biosynthesis of the unusual hydroxylated cyclic depsipeptide RP-1776 isolated from Streptomyces sp. Acta 2897
Author(s): Pohle, Stefan
Advisor(s): Süßmuth, Roderich
Referee(s): Süßmuth, Roderich
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Nichtribosomal synthetisierte Peptide sind Bestandteil des Sekundärmetabolismus vieler Mikroorganismen und dienen aufgrund ihrer strukturellen Diversität und vielfältige biologische Wirkungen als wichtige Leitstrukturen in der Wirkstoffforschung. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Aufklärung der Biosynthese der zyklischen Depsipeptide Acta A und RP-1776. Diese von Streptomyces sp. Acta 2897 synthetisierten Naturstoffe bestehen aus elf Aminosäuren, von denen fünf hinsichtlich der Konstitution nichtproteinogen sind: ß-MeAsp, ß-OH-Phe, ß-OH-O-Me-Tyr, ß-OH-Leu und α-OH-Gly. Die nichtproteinogene Aminosäure ß-Methylasparaginsäure ist Bestandteil von RP-1776, nicht jedoch von Acta A. Das hohe Ausmaß an ß-Hydroxylierungen und vor allem das stabile α-Hydroxyglycin wurden bisher nur selten für Peptidantibiotika beschrieben. Zusätzlich sind beide Peptide am N-Terminus von Threonin mit einem ungewöhnlichem 2-[1'-Z-Propenyl]-Zimtsäurerest verknüpft. RP-1776 hemmt durch spezifische Bindung an den Wachstumsfaktor PDGF-BB die Aktivierung der PDGF ß-Rezeptoren. Diese Rezeptoren sind wichtige Ziele in der Wirkstoffforschung, da sie unter anderem an der Ausbildung von Arteriosklerosen, Fibrosen und verschiedener Krebsarten involviert sind. Die Identifizierung der an der Biosynthese von Acta A und RP-1776 beteiligten Enzyme erfolgte über die Sequenzierung des zugehörigen Biosynthesegenclusters. Dazu wurde eine Cosmidbank von Streptomyces sp. Acta 2897 mit DNA-Sonden hybridisiert, die von konservierten Bereichen bekannter NRPS- und strukturmodifizierender Enzyme abgeleitet wurden. Nach der erfolgreichen Sequenzierung eines Teils des Biosynthesegenclusters wurden mittels wiederholten Hybridisierung und PCR-Experimenten Anschlusscosmide identifiziert, wodurch ein knapp 90 kbp umfassender Bereich sequenziert werden konnte. Durch Genunterbrechungsmutagenese konnte bestätigt werden, dass es sich dabei um das Biosynthesegencluster von Acta A und RP-1776 handelt. Die weiteren Untersuchungen von Tailoring-Enzymen erfolgte über in frame-Geninaktivierungen mit anschließender HPLC-ESI-MS- und -MS/MS-Untersuchung bzw. Charakterisierung von Kulturextrakten der generierten Mutanten. Auf diese Weise konnten zum einen die Enzyme determiniert werden, die für die strukturellen Modifikationen der nichtproteinogenen Aminosäuren verantwortlich sind. Zum anderen konnten neue Verbindungen identifiziert werden, denen z. B. die α- oder ß-Hydroxylierungen fehlten. Mit diesen Ergebnissen konnte erfolgreich ein Modell der nichtribosomalen Biosynthese der Naturstoffe Acta A und RP-1776 aufgestellt werden.
Nonribosomal synthesized peptides occur in the secondary metabolism of many microorganisms. Because of their structural diversity and biological activities they are important lead structures for drug development. The cyclic depsipeptide RP-1776, isolated from Streptomyces sp. Acta 2897 together with the natural derivative Acta A, selectively inhibits the binding of one type of platelet-derived growth factor (PDGF BB) to its extracellular domain of the PDGF ß-receptor. PDGF signalling pathways are involved in important cell processes like proliferation, migration and show hyperactivity in tumour cells. The structures of Acta A and RP-1776 contain 11 amino acids with a cinnamoyl moiety attached to the macrolactone ring. Nearly half of the amino acids are further modified by e.g. ß-hydroxylations and methylations whereas both peptides differ in the presence of methylaspartate. The most unusual modification in both compounds is an α-hydroxylation leading to a stable α-OH-Gly residue. In the present work the biosynthesis of Acta A and RP-1776 was investigated by sequencing of the corresponding gene duster and gene inactivation studies of tailoring enzymes that contribute to the diverse modifications of the core peptide structure.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus4-55666
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/4439
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4142
Exam Date: 15-Dec-2009
Issue Date: 12-Aug-2014
Date Available: 12-Aug-2014
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): Biosynthese
Depsipeptid
Gencluster
NRPS
PDGF
Biosynthesis
Depsipeptide
Gene cluster
NRPS
PDGF
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