Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4193
Main Title: Proteomanalysen der Virus‐Wirt‐Wechselwirkung von Kuhpockenviren
Translated Title: Proteome analysis of virus-host interactions of cowpox viruses
Author(s): Döllinger, Jörg
Advisor(s): Nitsche, Andreas
Referee(s): Garbe, Leif‐Alexander
Nitsche, Andreas
Lange, Harald A.
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Kuhpockenviren (CPXV) verursachen die häufigsten zoonotischen Orthopockenvirus (OPV) Infektionen in Europa und Nord- sowie Zentralasien 1. Das Virus besitzt das breiteste Wirtsspektrum der OPV und wird von Nagetieren sowie weiteren Wildtieren aber auch domestizierten Tieren auf den Menschen übertragen 2. CPXV besitzen außerdem die größte genetische Diversität und den größten Satz an OPV Genen, der auch alle open reading frames des Variola Virus (VARV) beinhaltet 2. Das Ansteigen von CPXV Infektionen beim Menschen in einer Gesellschaft mit abnehmender Immunität hat Bedenken wegen des zoonotischen Potentials des Virus hervorgerufen 1. Während das Vaccinia Virus (VACV) in der Literatur als Modell für Untersuchungen der Pathogenität und des Wirtstropismus von OPV dient, sind CPXV-spezifische Studien unterrepräsentiert. Die Charakterisierung der CPXV-Partikel, sowie die Analyse CPXV-stammspezifischer Papthogenitätsunterschiede, sollen als Grundlage dienen das Gefährdungspotential dieser aufkommenden Zoonose zukünftig besser einschätzen zu können. Im Gegensatz zum Vaccinia Viren (VACV) und Affenpockenviren (MPXV) ist die Proteinzusammensetzung des CPXV Mature Virion bisher nicht beschrieben. Die Zusammensetzung des CPXV Mature Virion (MV) Proteoms ist im Rahmen dieser Arbeit erstmals qualitativ und quantitativ mit Nano-Flüssigchromatographie (nLC) und Elektrospray-Ionisation (ESI) Tandem Massenspektrometrie (MS/MS)) basierten Proteomanalysen verschiedener Kuhpockenvirusisolate ebenso untersucht worden, wie die Ubiquitinierung von viralen Proteinen, und die Assoziation von Wirtszellproteinen. Das konservierte MV Proteom von drei verschiedenen CPXV Stämmen unterschiedlicher Ursprungsspezies besteht demnach aus 101 viralen Proteinen, die zu 25 % ubiquitiniert und mit 160 Wirtsproteinen assoziiert sind. Die zehn häufigsten viralen Proteine repräsen¬tieren dabei mehr als 50 mol% des Gesamtpartikels. CPXV und VACV MV unterscheiden sich in mittel und niedrig exprimierten Proteinen, zu denen immunmodulatorische Proteine und ein host-range Faktor zählen, die CPXV Schutz vor der Immunantwort in der frühen Replikationsphase bereits vor der Synthese früher Proteine bieten können. Die Ergebnisse reflektieren dabei die Situation in vivo, die durch einen breiteren Wirtstropismus und ein höheres pathogenes Potential von CPXV gegenüber VACV gekennzeichnet ist. Für Pockenviren ist bisher kein zellulärer Rezeptor beschrieben, es wird aber vermutet, dass zelluläre Faktoren für das attachment und den entry ubiquitär verbreitet sein müssen, da OPV die meisten Säugetierzelllinien penetrieren können. Mit einem Ansatz aus nativer Gelelektrophorese gekoppelt mit nLC-MS/MS und Cluster Analysen des Co-Migrationsverhaltens der Proteine im nativen Gel sind Proteinkomplexe zwischen der Membran humaner Zellen und CPXV während des attachments identifiziert und die Resultate der Cluster Analysen in einem attachment Netzwerk visualisiert worden. Einige der zellulären Membranproteine sind, wie vermutet, ubiquitär in verschiedenen Zelltypen verbreitet und innerhalb der Säugetiere hoch konserviert. Die vorliegenden Analysen der CPXV MV sind damit die bislang umfassendste Charakterisierung von OPV-Partikeln auf Proteomebene. Natürlich auftretende Infektionen und Tierexperimente haben gezeigt, dass die CPXV-Pathogenität von der Wirtsspezies, dem Infektionsweg und dem Virusstamm abhängig ist 3,4. Die Gründe für die Pathogenitätsunterschiede verschiedener CPXV-Stämme sind bisher unbekannt. In dieser Arbeit sind Mechanismen identifiziert worden, die für Pathogenitätsunterschiede verschiedener CPXV Stämme in vivo verantwortlich sein können. Zwei im Rattenmodell verschieden pathogene Stämme sind dafür in den Genomsequenzen, dem Wachstum auf verschiedenen Zelllinien, der viralen Proteinexpression und dem Einfluss auf das Proteom humaner Keratinozyten (HaCaT) miteinander verglichen worden. Die quantitativen shotgun Proteomanalysen der Viruspartikel, des Zellkulturüberstands, der für die Immunmodulation wichtige sekretierte Protein enthält, und des Zytoplasmas, dem Ort der viralen Replikation, sind mittels nLC-MS/MS und stable isotope dimethyl labeling durchgeführt worden. Diese Untersuchungen zeigen, dass sich OPV nicht nur in der Ausstattung und der Sequenz von immunmodulatorischen Proteinen unterscheiden, sondern diese zudem unterschiedlich stark exprimieren können. Die Pathogenitätsunterschiede der Stämme in vivo können demnach die Folge verschieden stark exprimierter viraler Zytokinrezeptoren und damit einer unterschiedlich effektiv inhibierten Immunantwort sein.
Cowpox Virus (CPXV) is the cause of most zoonotic orthopoxvirus (OPV) infections in Europe and North- as well as Central Asia 1. The virus has the broadest host range of OPV and is transmitted to humans from rodents and other wild and domestic animals 2. Furthermore, CPXV possess the largest set of OPV genes, which contain all Variola Virus (VARV) open reading frames 2. The rise of human CPXV infections in a society with declining immunity has raised concerns about the virus’ zoonotic potential 1. While Vaccinia Virus (VACV) is usually used as a model for the analysis of pathogenicity and host tropism of OPV, CPXV-specific studies are underrepresented in the literature. The characterization of CPXV-particles, as well as the analysis of strain-specific differences in pathogenicity, can serve as a foundation for the evaluation of the hazard potential of this emerging zoonoses in the future. In contrast to Vaccinia Virus (VACV) and Monkeypox Virus (MPXV), the protein composition of the CPXV Mature Virion (MV) is unknown. In this study, the proteome of CPXV viral particles has been analysed qualitatively and quantitatively using mass spectrometry based proteomic methods (nano-liquid-chromatography (nLC) and electrospray ionisation (ESI) tandem mass spectrometry (MS/MS)) for the first time, as well as the ubiquitination of virus proteins and associated host proteins. The conserved CPXV MV proteome of three various strains from different host species has been determined to consist of 101 viral proteins, 25 % of them are ubiquitinated and 160 host proteins are associated. The ten most abundant viral proteins represent more than 50 mol% of the virus particle. CPXV and VACV MV differ in medium and low abundant proteins, among them are immunomodulators and host range factors, which might protect CPXV from immune response in the early replication phase prior to protein synthesis. The results reflect the in vivo situation, which is characterized by a broader host range and higher pathogenic potential of CPXV compared to VACV. No cellular receptor for OPV has been identified so far, although it is assumed that cellular factors for attachment and entry need to be spread ubiquitously, since OPV can enter most mammalian cell lines. Cellular binding partners of viral membrane proteins during the attachment of CPXV to a human cell membrane have been identified by combining native gel electrophoresis and nLC-MS/MS with cluster analysis of the co-migration behavior of proteins in the gel. The results have been visualized in an attachment network. Some cellular members of the attachment complex are distributed ubiquitously in different cell types and are highly conserved among mammals. To date, the present analysis is the most comprehensive characterization of OPV particles on a proteome level. Naturally occuring infections and animal experiments have shown that pathogenicity of CPXV depends on the host species, the route of infection and the viral strain 3,4. Mechanisms that might be related to strain-specific pathogenicity in vivo have been identified in this thesis. Therefore, the genome sequence, the growth kinetics on different cell lines, the viral protein expression as well as the influence of an infection on the proteome of human keratinocytes (HaCaT) have been compared for two CPXV strains with different pathogenicity in a rat model. The quantitative shotgun proteome analysis of viral particles, the secretome, which contains proteins related with imunmodulation, and the cytoplasm, the place of the virus replication, have been carried using nLC-MS/MS and stable isotope dimethyl labelling. These investigations show for the first time that OPV differ not only in their equipment and sequence of virus-host interactors but also in their degree of expression. The different pathogenicity of the strains in vivo may therefore be the result of an altered expression of viral cytokine receptors, which might modulate the antiviral immune response with different effectivity.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus4-56891
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/4490
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4193
Exam Date: 11-Jul-2014
Issue Date: 26-Sep-2014
Date Available: 26-Sep-2014
DDC Class: 500 Naturwissenschaften und Mathematik
Subject(s): Kuhpockenvirus
Massenspektrometrie
Proteomik
Cowpox virus
Mass spectrometry
Proteomic
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