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Main Title: 3D microtissue models to target tumor dormancy and invasion processes
Translated Title: 3D Mikrogewebe zur Analyse von ruhenden Zellpopulationen und Invasionsprozessen
Author(s): Wenzel, Carsten
Referee(s): Lauster, Roland
Rappsilber, Juri
Steigemann, Patrick
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Trotz großer Fortschritte in der Krebsforschung und zahlreicher neuer Therapieansätze bleibt Krebs eine oftmals tödliche Erkrankung, die mehr als 14 Millionen Menschen im Jahr das Leben kostet. Ein großer Teil der präklinischen Forschung findet mit in vitro Zellkulturen statt, welche einige Aspekte der Krankheit im Labor abbilden können. Diese zellbasierten Modelle werden genutzt, um aus großen Substanz-Bibliotheken wirksame Substanzen zu identifizieren, die das Überleben oder Wachstum der Krebszellen verhindern können. Eine Haupteigenschaft von Krebszellen ist ihre gesteigerte Zellteilungsrate. Substanzen, die schnell teilende Krebszellen töten werden daher oft in der Chemotherapie verwendet. Auftretende Resistenzen führen dabei jedoch häufig zum Scheitern der Therapie und der Tumor kommt nach anfänglich erfolgreicher Behandlung zurück. Mit steigender Distanz zu versorgenden Blutgefäßen nimmt der Mangel an Sauerstoff und Nährstoffen im Tumor rapide ab. In der Folge nimmt die Zellteilung der Tumorzellen ab und eine ruhende Zellpopulation im Tumor entsteht. Da zellteilungshemmende Zytostatika vornehmlich schnell wachsende Zellen töten, wird angenommen, dass die ruhende Population möglicherweise verschont wird und zum Rückfall der Erkrankung führt. Die Entdeckung von Substanzen, die schlecht versorgte, ruhende Zellen im Tumor töten können, ist eine vielversprechende Möglichkeit, um die Wirksamkeit von zytostatika-basierter Chemotherapie zu erhöhen. Multizelluläre Tumorsphäroide (MZTS) ermöglichen ein 3-dimensionales Wachstum von Krebszellen und können damit einige Parameter der Tumorumgebung in vitro abbilden. Durch Nährstoff- und Sauerstoffgradienten innerhalb der MZTS, wie sie auch im in vivo Tumor vorhanden sind, entsteht eine ruhende Zellpopulation. Die Evaluierung dieser 3D Zellkulturen mit automatisierter Mikroskopie und Bildanalyse (sog. High-Content Analysis oder High-Content Screening) erlaubte es 9 Substanzen in einem Pilotscreen (aus 1120 Substanzen) zu identifizieren, die spezifisch Zellen in der ruhenden Population von MZTS abtöten. Zusätzlich konnte der Wirkmechanismus der Substanzen als Inhibitoren der Atmungskette charakterisiert werden und eine verbesserte Wirksamkeit in der Kombination mit Zytostatika konnte in vitro bestätigt werden. Die Daten legen nahe, dass die Nutzung von Atmungsketteninhibitoren in Kombination mit Zytostatika einen sinnvollen therapeutischen Ansatzpunkt liefert. In einem zweiten Ansatz wurde ein 3D Ko-Kulturmodell zur Abbildung von fibrotischen Prozessen evaluiert, wie sie in Krankheitsbildern wie der idiopathischen pulmonalen Fibrose (IPF) auftreten. IPF wird jährlich bei 50.000 Menschen diagnostiziert und hat eine hohe Mortalitätsrate. Das Einwachsen von Fibroblasten in Lungengewebe lässt das Gewebe vernarben und reduziert die Sauerstoffaufnahme drastisch. Bisher existieren keine erfolgreichen Therapiemöglichkeiten. Das entwickelte 3D Ko-Kulturmodell imitiert den Einwanderungsprozess von Fibroblasten in 3D Sphäroidgewebe in vitro. Dieses hochdurchsatz-fähige Screening-Modell hat es ermöglicht 16 Substanzen zu identifizieren, welche das Einwandern von Fibroblasten verhindern können. Dabei konnten 2 Signalwege identifiziert werden, die ebenfalls für die Entstehung von IPF in vivo relevant sind, was die Validität dieses 3D Ko-Kulturmodells bestätigen konnte. Zusammengefasst bildet diese Arbeit damit die Grundlage komplexe 3D Zellkulturen in der frühen Wirkstofffindung im Hochdurchsatz-Screening anzuwenden, um für verschiedene Erkrankungen neue Wirkstoffkandidaten zu entdecken. Neue Substanzen und Signalwege konnten dabei identifiziert werden. Durch eine physiologischere Abbildung der Erkrankungen ist die Wahrscheinlichkeit höher, dass die Substanzen auch in vivo aktiv sind und damit bei der Medikamentenentwicklung die hohe Fehlerrate in der präklinischen Entwicklung verringern können.
Despite all efforts to discover novel therapeutic options to treat cancer the disease remains devastating causing more than 14 million deaths in 2012 - and the trend is rising. Some parts of the preclinical drug discovery process rely on cell culture models to reproduce the pathophysiological features of cancer in in vitro experiments. These cellular models are then used in screening campaigns that aim to identify substances such as small molecules, peptides, or interfering RNA that alter the phenotype of a cancer cell in a desired manner. One of the main properties of cancer cells is their uncontrolled cell division. Accordingly, the cell cycle is a major target for chemotherapy, but resistance to chemotherapy frequently causes treatment failure in patients with advanced and inoperable cancer. As the distance from supplying blood vessels increases, oxygen and nutrient concentrations decrease and cancer cells react by halting cell cycle progression and entering a dormant state. As cytostatic drugs mainly target proliferating cells, cancer cell dormancy is considered a major resistance mechanism to this class of anti-cancer drugs. Therefore, substances that target cancer cells in poorly vascularized tumor regions have the potential to enhance cytostatic-based chemotherapy in solid tumors. Multicellular tumor spheroids (MCTS) allow for three-dimensional growth conditions, thus reproducing several parameters of the tumor microenvironment, including oxygen and nutrient gradients as well as the development of dormant tumor regions. Here, the evaluation of a 3D cell culture high-content screening system led to the identification of nine substances from two commercially available drug libraries that specifically target cells in inner MCTS core regions. Subsequently, the mode of action of the identified compounds could be identified as respiratory chain inhibitors. Ultimately, benefits in combinational treatment with commonly used cytostatics in MCTS were proven. The data suggest a rationale to find and evaluate new substances that target the altered metabolism of tumor cells in dormant tumor regions to enhance cytostatic-based therapies. In a second approach the combination of different cell types in a 3D cell co-culture model was evaluated, which allows monitoring of invasion processes in different malignancies. Among them idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) currently affects 50.000 people per year with high mortality rates. The disease is marked by increased scarring and fibroblast invasion into normal lung tissue with currently no treatment options available. The developed 3D invasion model mimics invasion processes of fibroblasts in tissue surrogates in vitro. This screening-compatible assay allowed for the identification of compounds that inhibit or modulate uncontrolled fibroblast invasion into tissue. Finally, 16 compounds from a screening library could be identified that strongly decreased fibroblast invasion. Two target pathways were determined that included substances currently under investigation in animal models or even used in clinical studies for the treatment of IPF, proving the validity of the developed in vitro 3D co-culture system. In summary, this work provided novel 3D cell (co-) culture approaches for indications for which no appropriate screening compatible in vitro assays in preclinical drug discovery yet exist. New compounds and targets in different disease models could be identified by the developed assay. Finally, by providing increased physiological relevance the in vitro assays help to predict compound efficacy with higher probability of in vivo activity and can therefore reduce attrition rates in preclinical drug development.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus4-57261
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/4502
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4205
Exam Date: 26-Sep-2014
Issue Date: 16-Oct-2014
Date Available: 16-Oct-2014
DDC Class: 500 Naturwissenschaften und Mathematik
Subject(s): 3D Zellkultur
multizelluläre Tumor Sphäroide
Hochdurchsatz Screening
Atmungsketteninhibitoren
invasive Prozesse
3d cell culture
high-content screening
respiratory chain inhibitors
multicellular tumor spheroids
Usage rights: Terms of German Copyright Law
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