Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4208
Main Title: Mechanisms in biological electron transfer
Subtitle: Raman spectroscopic investigations of cytochrome c and CoFeSP
Translated Title: Mechanismen des biologischen Elektronen-Transfers
Translated Subtitle: Raman spektroskopische Untersuchungen von Cytochrome c und CoFeSP
Author(s): Meister, Wiebke
Advisor(s): Hildebrandt, Peter
Referee(s): Hildebrandt, Peter
Dobbek, Holger
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Proteine, die Elektronen übertragen können, lassen sich in zwei Gruppen einteilen. Die eine Gruppe bezieht sich auf Proteine, deren Funktion ausschließlich der Elektronentransfer (ET) zwischen Donor und Akzeptor ist, während bei Proteinen der zweiten Gruppe der ET mit weiteren Prozessen verbunden ist. Das Ausmaß der Kopplung zwischen ET und Proteindynamik ist in beiden Gruppen qualitativ unterschiedlich. Um zum allgemeinen Verständnis der zugrundeliegenden Prinzipien beizutragen, wurden in dieser Arbeit Vertreter beider Gruppen untersucht. Ein Vertreter der zweiten Gruppe ist das CoFeSP Protein, das einen Cobalamin Kofaktor enthält. CoFeSP, das eine wichtige Rolle im Stoffwechsel anaerober Mikroorganismen spielt, wird reduktiv vom [FeS]-Protein RACo aktiviert. Mithilfe von Resonanz-Raman (RR) Spektroskopie wurde gezeigt, dass die Komplexbildung von einer Konformationsänderung begleitet wird, die die axiale Koordination des Kobalts im CoFeSP und damit auch die elektronische Struktur des Corrins verändert. Dies führt vermutlich zu einer Verschiebung des Redoxpotentials des Corrinioids, so dass die reduktive Reaktivierung durch den [2Fe2S]-Cluster des RACo ermöglicht wird. Die wechselwirkenden Domänen der Partnerproteine konnten anhand von Untersuchungen an Deletionsmutanten identifiziert werden. Diese Ergebnisse wurden durch jüngste kristallographische Ergebnisse bestätigt. Als Beispiel für ein "einfaches" ET-Protein der ersten Gruppe wurden das Hämprotein Cytochrome c (Cytc) und seine ET-Reaktionen mit (zeitaufgelöster) oberflächenverstärkten Resonanz-Raman [(TR)-SERR] Spektroskopie untersucht. Cytc dient primär als Elektronentransporter zwischen membrangebundenen Reaktionspartnern in der Atmungskette aerober Organismen. Der Wildtyp (WT) und Lysin?Cystein Proteinvarianten, mit Mutationen innerhalb und außerhalb der Bindungsdomäne, wurden elektrostatisch auf Ag-Elektroden immobilisiert, die zuvor mit negativ geladenen selbstorganisierten Monolagen (SAMs) bedeckt wurden. Die aus den TR-SERR Experimenten gewonnenen Kinetiken des heterogenen ET ermöglichten die Analyse der Zusammenhänge zwischen Elektronentunneln und Orientierungsdynamik des adsorbierten Proteins. Die experimentellen Ergebnisse, zusammen mit in Kooperation durchgeführten Rechnungen, zeigen die entscheidende Rolle lokaler elektrostatischer Felder in der Elektrode-/ SAM-/Protein-Grenzschicht für den Redoxprozess. In seiner zweiten Funktion wirkt Cytc als Cardiolipin(CL)-Peroxidase. Dabei ist der Redoxprozess mit internen Konformationsänderungen gekoppelt, die die CL-Bindung erlauben und durch die Abtrennung des sechsten axialen Fe-Liganden ein katalytisches Zentrum generieren. Es wird angenommen, dass diese Funktion durch post-translationale Modifikationen von Tyrosinresten unterstützt wird. Um die potentiellen strukturellen Änderungen am Redoxzentrum zu identifizieren, wurden der WT und „phosphomimetische" Tyrosin-Mutanten RR spektroskopisch untersucht. Allerdings lieferten die Ergebnisse keine eindeutigen Hinweise auf Strukturänderungen des Hämzentrums aufgrund der Modifikationen an benachbarten Tyrosinen. Die SERR-Spektroskopie von ET-Proteinen auf SAM-beschichteten Elektroden ist eine Schlüsseltechnik zur Untersuchung des biologischen ET an Grenzflächen. Deshalb wurde diese Methode in dieser Arbeit kritisch begutachtet. Um die Übertragbarkeit der spektroelektrochemischen Ergebnisse auf physiologische Bedingungen zu überprüfen, wurden die SERR-Experimente an immobilisiertem Cytc bei deutlich höherer und den intrazellulären Bedingungen vergleichbarer Ionenstärke ausgeweitet. Während die ET-Kinetik bei höherer Ionenstärke langsamer wurde, wurde das Redoxpotential positiv verschoben. Es wurde gezeigt, dass der langsamere ET primär auf eine veränderte Orientierungsverteilung des Cytc zurückzuführen ist. Ein Nachteil der TR-SERR Spektroskopie ist die relativ hohe Streuung der kinetischen Daten. Die in dieser Arbeit vorgenommene Untersuchung ergab einen unerwarteten, relativ starken "personenbezogenen" Effekt. Dies kann letztlich auf den je nach Experimentator unterschiedlichen Druck zurückgeführt werden, mit dem die Elektrode im ersten Schritt der Oberflächenmodifikation "poliert" wird. Daraus können unterschiedliche Oberflächenmorphologien resultieren, die die Bildung und die Struktur der SAMs und damit auch die elektronische Kopplung zwischen der Elektrode und dem immobilisierten Protein beeinflussen können.
Proteins involved in biological electron transfer (ET) can be divided into two groups. These are proteins that solely transfer electrons between electron donors and acceptors, and redox proteins that link ET with other processes. In these two cases the extent of coupling between ET and protein dynamics is qualitatively different. To contribute to a general understanding of underlying principles, representatives of both groups are investigated in this thesis. A representative of the second group is the cobalamin-containing protein CoFeSP, an essential component in the acetyl-CoA pathway. It is reductively activated by the [FeS] protein RACo. Using resonance Raman (RR) spectroscopy it is shown that complex formation is accompanied by a conformational change that affects the axial coordination of the cobalt in CoFeSP leading to the perturbation of the electronic structure of the corrin. This change supposedly alters the redox potential of the corrinoid to facilitate the otherwise uphill reduction by the [2Fe2S]cluster of RACo. With investigations on deletion mutants of both proteins it was possible to identify the interacting domains of the partner proteins, consistent with recent crystallographic data. As an example for a "simple" ET protein, cytochrome c (Cytc) and its ET reactions were studied by (time-resolved) surface enhanced resonance Raman spectroscopy [(TR) SERR]. Cytc primarily serves as an ET shuttle in the respiratory chain interacting with membrane-bound proteins. Cytc wild type (WT) and selected variants with lysines-to-cysteine substitutions in and remote from the binding domain were electrostatically immobilized onto Ag electrodes coated with carboxyl-terminated selfassembled monolayers (SAMs) of different length. The determination of the apparent rate constants of the interfacial ET of the heme were analysed to elucidate the interplay between the rotational reorientation and the electron tunneling. The experimental data, complemented by theoretical calculations (in collaboration) demonstrate the crucial role of the electrostatic field in the electrode /SAM/ protein interface for controlling the gated electron transfer process. In its second function Cytc acts as a peroxidase catalyzing the peroxidation of cardiolipin (CL). Thus, this function involves a coupling of the redox process with internal conformational changes of the protein to allow CL binding and generation of a catalytic center via the removal of the 6th axial Fe-ligand. This function which is assumed to be promoted by post-translational modifications of internal tyrosine residues was studied by RR spectroscopy. Comparing WT and "phosphomimetic" tyrosine mutants potential structural changes at the redox site were analysed. However, the results do not provide a distinct and unambiguous indication for alterations of the heme center due to the modification of nearby tyrosines. As SERR spectroscopy of ET proteins immobilized on SAM-coated electrodes is a key approach for studying interfacial biological ET, this methodology was critically assessed. To examine the transferability of conclusions derived from spectroelectrochemical experiments on simple model systems to physiological conditions, the experiments on Cytc, bound to SAM-coated electrodes, were extended to significantly higher ionic strengths that are close to those in cellular systems. While the ET kinetics were slowed down at higher ionic strength, the redox potential was found to be positively shifted. It was shown that the slower ET kinetics were therefore not an electric field effect but the result of a change in the orientation distribution of Cytc due to the higher ionic strength. A drawback of TR SERR spectroscopy is the relative large scattering of kinetic data, the origin of which was systematically explored in this thesis. The analysis revealed an unexpected and relatively strong "personal" effect on the kinetic data. A possible explanation is based on different pressures applied upon surface polishing that could lead to differing surface morphologies. This in turn might influence the formation of the SAM and the SAM structure and thus may result in different electronic couplings between the redox center of the immobilised protein and the electrode.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus4-57368
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/4505
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4208
Exam Date: 19-Sep-2014
Issue Date: 25-Nov-2014
Date Available: 25-Nov-2014
DDC Class: 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Subject(s): Biologischer Elektronentransfer
Cytochrome c
Elektrochemie
Elektronentransfer- Kinetik
Oberflächenverstärkte Resonanz Raman Spektroskopie
Biological electron transfer
Cytochrome c
Electrochemistry
Electron transfer kinetics
Surface enhanced resonance raman spectroscopy
Creative Commons License: https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0/de/
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