Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4233
Main Title: Cyanobacterial Photosystem II in a native-like superstructure at 2.44 Å resolution and first serial femtosecond X-ray studies
Translated Title: Cyanobakterielles Photosystem II in einer nativ-ähnlichen Superstruktur mit 2,44 Å Auflösung und erste Femtosekunden-Röntgenbeugungsstudien
Author(s): Hellmich, Julia
Advisor(s): Zouni, Athina
Referee(s): Zouni, Athina
Friedrich, Thomas
Grimm, Bernhard
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Photosystem II (PSII) ist ein homodimerer Protein-Kofaktor-Komplex und ein Schlüsselenzym in der Elektronentransportkette der Photosynthese, in der Wasser und Kohlenstoffdioxid zu Sauerstoff und Kohlenhydraten umgewandelt werden. PSII befindet sich in der Thylakoidmembran von Pflanzen, Algen und Cyanobakterien. Nach der Absorption von Licht im Reaktionszentrum von PSII wird Wasser am katalytischen Zentrum, einem Mn4CaO5-Cluster, oxidiert. Der detailierte Mechanismus der Wasseroxidation ist bislang ungeklärt. Um diesen einzigartigen katalytischen Mechanismus und die native strukturelle Anordnung des PSII Komplexes aufzuklären, werden hochqualitative PSII Kristalle benötigt. Der erste Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf die Optimierung der Kristallisation von dimeren PSII Kernkomplexen (dPSIIcc) des Cyanobakteriums Thermosynechococcus elongatus. Dafür wurde eine neue Extraktions-, Aufreinigungs- und Kristallisationsprozedur entwickelt, bei der ausschließlich das Detergenz Octaethyleneglycolmonododecylether (C12E8), anstelle des sonst üblichen n-dodecyl-ß-D-maltoside (βDM) verwendet wurde. Das Detergenz βDM kokristallisiert mit den dPSIIcc (zu Membranproteinkristallen des Typs II) und wurde teilweise in die dPSIIcc eingebaut, weswegen ein destabilisierender Effekt auf die native dPSIIcc-Form angenommen wurde. Mit der neuen Prozedur wurden fast ausschließlich dPSIIcc und nur minimale Mengen monomerer PSIIcc erhalten, wobei alle 20 Proteinuntereinheiten vorhanden sind, einschließlich der Proteinuntereinheit PsbY, welche zumindest teilweise in allen vorherigen PSIIcc-Kristallstrukturen fehlte. Zunächst erzielten die erhaltenen Typ II-Kristalle Röntgenbeugungsdaten mit maximal 6 Å Auflösung. Eine Kristallisationsnachbehandlung der dPSIIcc Kristalle mit PEG 5000 MME bewirkte die Extraktion von Wasser und C12E8 und wandelte die Kristalle zu Typ I-Membrankristallen um (Kristallpackung ohne kokristallisierte Detergenzgürtel), was zu einer verbesserten Auflösung von 2.44 Å führte. Die transformierten Kristalle zeigen die dPSIIcc in Reihen angeordnet, so wie sie durch Elektronenmikroskopie von cyanobakteriellen Thylakoidmembranen gefunden wurden. Die perfekte Übereinstimmung deutet darauf hin, dass die Röntgendiffraktionsdaten das erste hochaufgelöste Model von nativen dPSIIcc Superstrukturen liefern. Mögliche Folgerungen dieser Anordnung für die effiziente Nutzung der Sonnenenergie werden betrachtet. Der zweite Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf die Aufklärung des fünfschrittigen katalytischen Zyklus der Wasseroxidation am Mn4CaO5-Cluster. Röntgendiffraktion an Synchrotronquellen führt zu Strahlenschädigung in den PSII Kristallen, welche Änderungen der Oxidationsstufen und der Mn-Mn Abstände im Mn4CaO5-Cluster hervorruft. Eine neue Methode, in der in Serie geschaltete femtosekunden-Röntgen-Kristallographie in Kombination mit Röntgenemission benutzt wird, wurde mit dPSIIcc-Mikrokristallen durchgeführt. Mit dieser Methode konnten Daten vor dem Beginn von Strahlenschädigung bei Raumtemperatur aufgenommen werden. Präsentiert werden erste Daten von dPSIIcc Kristallen im dunkeladaptierten Zustand und im ersten belichteten Zustand. Ein negativer Einfluss des stark reduzierenden Röntgenlasers auf den Mn4CaO5-Cluster konnte experimentell durch zeitgleiche Röntgenemissionsmessungen und den Vergleich mit Datensätzen von Synchrotronquellen ausgeschlossen werden. Mit dieser Arbeit wird ein erster Schritt hin zur Aufklärung des katalytischen Zyklus der Wasseroxidation präsentiert.
Photosystem II (PSII) is a homodimeric protein-cofactor complex and a key enzyme of the electron transport chain of photosynthesis, the process where water and carbon dioxide are transformed to oxygen and carbohydrates. PSII is located in the thylakoid membrane of plants, algae and cyanobacteria. After the absorption of sunlight in PSII, water is oxidized at its catalytic center, a Mn4O5Ca-cluster. The detailed mechanism of water oxidation is yet unclear. To study this unique catalytic mechanism and the native structural organization of the PSII complex, high quality PSII crystals are needed. The first part of the present work focuses on the optimization of the crystallization of the dimeric PSII core complex (dPSIIcc) from the cyanobacterium Thermosynechococcus elongatus. A new extraction, purification and crystallization procedure was established using the detergent octaethyleneglycolmonododecylether (C12E8) instead of the commonly used n-dodecyl-ß-D-maltoside (βDM). The detergent βDM was found co-crystallized with dPSIIcc (type II membrane protein crystals) and was partly incorporated in the PSII complex, thereby it was assumed to destabilize the native dPSIIcc form. With the new procedure, almost exclusively dPSIIcc and only minimal amounts of monomeric PSIIcc are obtained. All 20 protein subunits are completely present including PsbY, which was at least partly absent in all earlier PSIIcc crystal structures. Initially, the obtained crystals were of type II and yielded X-ray diffraction (XRD) data of at most 6 Å resolution. A post-crystallization treatment with PEG 5000 MME effected an extraction of water and C12E8 and converted the dPSIIcc crystals to type I membrane protein crystals (packing without co-crystallized detergent belts), which resulted in an improved resolution of 2.44 Å. The transformed crystals show dPSIIcc packed in rows as found by electron microscopy of cyanobacterial thylakoid membranes. The perfect match suggests the new XRD data to represent the first high-resolution model of native dPSIIcc superstructures. Possible implications of this arrangement for an efficient use of solar energy are considered. The second part of this work focuses on the elucidation of the five-step catalytic cycle of water oxidation at the Mn4CaO5-cluster. The commonly established method of XRD at synchrotron sources leads to radiation damage within PSII crystals. A new method called serial femtosecond X-ray crystallography with combined XRD and X-ray emission (XES) was applied to dPSIIcc microcrystals. The method allows for data collection before the onset of radiation damage at room temperature. Here, first XRD and XES data of dPSIIcc crystals in the dark adapted state and the first illuminated state are presented. A negative impact of the highly reducing X-ray laser on the protein integrity and the radiation sensitive Mn4O5Ca-cluster could be excluded by simultaneous XES measurements and the comparison with XRD data sets obtained at synchrotron sources. With this work, a first step towards the elucidation of the catalytic cycle of water oxidation is presented.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus4-58436
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/4530
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4233
Exam Date: 2-Oct-2014
Issue Date: 6-Nov-2014
Date Available: 6-Nov-2014
DDC Class: 541 Physikalische Chemie
Subject(s): Photosystem II
Kristallisation
XFEL
Superstruktur
Mangancluster
Photosystem II
crystallization
XFEL
superstructure
manganese cluster
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