Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4246
Main Title: Analytik und Transformation von Flavonoiden durch anaerobe und aerobe Bakterien
Translated Title: Analysis and transformation of flavonoids by aerobic and anaerobic bacteria
Author(s): Schütt, Denise
Advisor(s): Garbe, Leif-Alexander
Referee(s): Garbe, Leif-Alexander
Bader, Johannes
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Seit einiger Zeit stehen die physikochemischen Eigenschaften von sekundären Pflanzenstoffen, vor allem im Hinblick auf die Gesundheit des Menschen, im Fokus vieler in vitro und in vivo Studien. Dennoch sind bis heute viele Mechanismen der Metabolisierung und Modifikation der Flavonoide und deren Abbauprodukte ungeklärt. Die vorliegende Arbeit besteht aus drei Arbeitspaketen, von denen sich ein Paket mit der Etablierung und Validierung einer reproduzierbaren Hochleistungsflüssigkeitschromatographie Methode zu Analyse der Flavonoide Cyanidin-3-O-glucosid, Cyanidin-3-O-rutinosid, Delphinidin-3-O-glucosid, Delphinidin-3-O-rutinosid und Quercetin-3-O-rutinosid (Rutin) sowie ihrer Abbauprodukte während der Umsetzung im in vitro Verdauungsmodell beschäftigte. Die beiden anderen Pakete betrachteten die Umsetzung der Flavonoide durch Mikroorganismen unter aeroben Bedingungen in einem reproduzierbaren in vitro Verdauungsmodell und unter anaeroben Bedingungen durch das Bakterium Rhodococcus erythropolis DSM 44534. Im in vitro Verdauungsmodel wurde die Umsetzung der Flavonoide unter enzymatischen sowie enzymatisch-mikrobiellen Bedingungen betrachtet. Dazu wurden zum einen die Anthocyane als Reinsubstanzen sowie in verschiedenen Lebensmittelmatrices eingesetzt. Bei der rein enzymatischen Umsetzung der Anthocyanaglykone wurden bereits am Ende der Duodenumpassage nur noch 0,5 % der Ausganskonzentration an Aglykonen gefunden. Bei den Glucosiden lag die Konzentration der Anthocyane während der enzymatisch-mikrobiellen Umsetzung am Ende der Metabolisierungsversuche in den verschiedenen Ansätzen zwischen 6 % und 20 % bezogen auf die Ausgangskonzentration. Für das reine Rutin konnte im Verlauf der Umsetzung eine Konzentrationsabnahme von 40 % detektiert werden. Neben dem Abbau der Flavonoide konnte auch die Bildung eines Protein-Flavonoid-Komplexes beobachtet werden, welche die Flavonoide für die Analytik maskiert und die Ergebnisse für den Konzentrationsverlauf während der Umsetzung negativ beeinflusst. Aus diesem Grund wurde eine Resolubilisierungsmethode erfolgreich etabliert und validiert, wodurch eine korrekte Bilanzierung des Metabolismus ermöglicht wurde. Neben der starken Komplexierung der Flavonoide im Magensegment wurde vor allem ein Großteil der Anthocyane bei der Probenvorbereitung präzipitiert (63 % im Duodenum beim Gärgetränk aus Basis von Bierwürze und Johannisbeersaft). Zusätzlich konnten die Zunahme von Polymerisierungen und Copigmentierungen der Anthocyane und ihrer Abbauprodukte im Verlauf des in vitro Modells nachgewiesen werden. Überdies konnte eine Zunahme der antioxidativen Kapazität für Anthocyane und Rutin in den einzelnen Verdauungsstufen gemessen werden. Hier stieg die antioxidative Kapazität exemplarisch für den Heißwasserextrakt von 5,4 mmol/ml Troloxequivalent zu Beginn der Umsetzung auf 24,6 mmol/ml Troloxequivalent am Ende an. Die Ergebnisse zeigen, dass der Abbau der Anthocyane im in vitro Verdauungsmodell hauptsächlich auf physikochemischen Einflüssen, sowie zahlreichen Nebenreaktionen (Polymerisierung, Copigmentierung) beruht. Das Rutin hingegen wird enzymatisch-mikrobiell metabolisiert. Im dritten Teil der Arbeit wurde durch die Zugabe von Rutin zum Kultivierungsmedium die Bildung einer Rutinase induziert, welche Rutin zu Quercetin und Rutinosid spaltet. Das Enzym wurde im Rahmen der Arbeit teilweise aufgereinigt, wobei ein isoelektrischer Punkt von 6,4 und ein Molekulargewicht von 48 kDa bis 74 kDa für die Rutinase gefunden wurden. Weiterhin wurde der Einfluss verschiedener Kohlenstoff-Quellen auf den Aufbau der Zellhülle von R. erythropolis untersucht. Die gezielte Untersuchung der Mykolsäuren mittels Elektronenspray-Ionisations-Tandem-Massenspektrometrie zeigte, dass sich in Gegenwart von Zitronensäure im Kultivierungsmedium der Anteil an mehrfach ungesättigten Mykolsäuren (zwei-, drei- und vierfach ungesättigt) auf 35 % für die Meromykolatkette im Vergleich zu Rutin als C-Quelle mit 17 % erhöht. Im α-Alkyl-Zweig lag der Anteil bei nur 3 % für das Rutin und 23 % für die Zitronensäure. Vierfach ungesättigte Meromykolatketten konnten nur in Gegenwart von Zitronensäure als C-Quelle gefunden werden. Mit der Zunahme der ungesättigten Mykolsäuren in den Ansätzen mit Zitronensäure ging eine Veränderung der Permeabilitätsbarriere einher. Dies konnte anhand der Ergebnisse aus der Ziehl-Neelsen-Färbung belegt werden. Sowohl die Zitronensäure als auch das Rutin nahmen im Laufe der Kultivierung auf unterschiedlichen Wegen Einfluss auf die gebildeten Enzyme, das Wachstum und die Permeabilität der Rhodococcus erythropolis DSM 44534 Zelle.
For some time, the physicochemical properties of secondary plant material have been the focus of many in vitro and in vivo studies, especially with regard to human health. However, neither the underlying metabolic mechanisms nor the modification of the flavonoids and their decomposition products have been fully elucidated. The present dissertation consists of three work packages. In the first, a reproducible high performance liquid chromatography method for the analysis of cyanidin-3-O-glucoside, cyanidin-3-O-rutinoside, delphinidin-3-O-glucoside, delphinidin-3-O-rutinoside, quercetin-3-O-rutinoside (rutin) and their degradation products was established and validated. The other packages consider the conversion of the flavonoids by microorganisms through creating aerobic conditionsin a reproducible in vitro digestion model, on the one hand, and anaerobic conditions through thebacterium Rhodococcus erythropolis DSM 44534, on the other. The conversion of the flavonoids underenzymatic or microbial degradation was examined in the in vitro digestion model. The anthocyanins came as pure substances or in different food matrices based on black-currant juice. Only 0,5 % of the initial concentration of aglycones was found after the enzymatic conversion. The glycosides, in contrast, amounted to between 6 % and 20 % of the initial concentration of anthocyanin in different formulations. The rutin concentration decreased ultimately to 40 % of the simulated digestion model during the enzymatic and microbial degradation. Besides metabolization, the model showed that the analytes complexed through proteins from the artificial digestive juice and food matrices. This protein-flavonoide complex masked the flavonoids, which explains the low recovery rate of these compounds in analytic results. In order to correct for this, a resolubilisation method was developed and validated successfully. Apart from the flavonoids complexing extensively in the stomach, a major part of anthocyanins was precipitated during the sample preparation. Regarding the samples of fermented beverages, 63 % of the anthocyanins was bound by proteins at the end of the ileum. These masked anthocyanines significantly influenced the results of the concentration progress during the conversion in the in vitro digestion model. The model illustrated additionally the polymerization and co-pigmentation of the anthocyanins and their degradation products. In the process of the in vitro digestion model, the amount of polymeric anthocyanins increased. In determining the antioxidant capacity at the individual digestion levels, the same was true for anthocyanins and rutin. The antioxidant potential of the hot water extract, for example, increased from 5,4 mmol/ml trolox equivalent at the beginning of the stomach segment to 24,6 mmol/ml trolox equivalent at the end of the descending colon. The results reveal that the degradation of anthocyanins in the in vitro digestion model mainly bases on physicochemical influences, in addition to a great number of secondary reactions (polymerization,co-pigmentation). Rutin, by contrast, is metabolized by enzymatic-microbial influences. In a third step, rutin was degraded aerobically through the bacterium Rhodococcus erythropolis DSM 44534. A rutinase was thus induced to decompose rutin into quercetin and rutinosid. The tentative rutinase was partially purified, whereby an isoelectric point of 6,4 and a molecular weight of 48 kDa and 74 kDa was found for enzyme fractions, which decomposed rutin. Furthermore, the influence of different carbon sources on the assembly of the cell layer of R. erythropolis and their correlated changes in the permeability barrier was examined. The targeted analysis of mycolic acid by electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) showed a correlation between the number of double bonds and the carbon source. In the presence of citric acid in the culture medium, the number of polyunsaturated mycolic acids increased to 35 % for the meromycolate chain compared to rutin as a carbon source to 17 %. The number of polyunsaturated mycolic acids in the α-alkyl-branch was 3 % and 23 % for the rutin and citric acid respectively. When rutin was used as a sole carbon source, no fourfold unsaturated mycolic acid occurred. Through the increase in unsaturated mycolic acid, the permeability barrier changed. The results obtained from Ziehl-Neelsen staining confirmed this change. Both citric acid and rutin influenced during cultivation in different ways not only the enzymes formed, but also growth and permeability barrier of the Rhodococcus erythropolis DSM 44534 cell layer.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus4-58717
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/4543
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4246
Exam Date: 20-Jun-2014
Issue Date: 14-Nov-2014
Date Available: 14-Nov-2014
DDC Class: 543 Analytische Chemie
Subject(s): Anthocyane
Künstliches Darmmodell
Mykolsäure
Protein-Flavonoid-Komplex
Rutinase
Rutinase
mycolic acid
anthocyanins
digestion model
protein-flavonoide complex
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