Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4346
Main Title: Spectroscopic and microscopic analysis of arrestin-rhodopsin interactions
Translated Title: Spektroskopische und mikroskopische Analyse der Interaktion von Arrestin und Rhodopsin
Analyse spectroscopique et microscopique de l'interaction entre l'arrestin et la rhodopsin
Author(s): Beyrière, Florent
Advisor(s): Hofmann, Klaus Peter
Referee(s): Hildebrandt, Peter
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: G Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind Transmembran-Rezeptoren, die dafür verantwortlich sind, chemische Signale zu empfangen und diese Signale durch die Plasmamembran an G-Proteine weiterzugeben. Die Bindung von aktivierenden Liganden (Agonisten) leitet die Interaktion des Rezeptors mit dem G- Protein ein und löst so die Signaltransduktion aus. Rhodopsin ist der am besten untersuchte GPCR und daher zum Modell dieser Rezeptorklasse geworden. Im Gegensatz zu anderen GPCRs ist der 11-cis-Retinal-Ligand im inaktiven Dunkelzustand bereits am Apoprotein Opsin gebunden. Die lichtinduzierte Isomerisierung des 11-cis-Retinals zum Agonisten all-trans-Retinal führt zu Konformationsänderungen und der Aktivierung des Rezeptors. Vor dem Zerfall des aktivierten Rezeptors in Opsin und freies all-trans-Retinal, wird die G-Protein Aktivierung durch Phosphorylierung des Rezeptors und der nachfolgenden Bindung von Arrestin geblockt. Obwohl Röntgenkristallstrukturen sowohl der basalen als auch der preaktivierten Arrestinkonformationen bekannt sind, ist die molekulare Organisation des Arrestin/Rezeptor Komplexes unklar. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die gemeinsame Sequenz der vier Arrestin Typen und dem G-Protein der Stäbchenzelle (Gt) untersucht. Die vier Arrestin Typen sind dafür verantwortlich, die Signalweiterleitung der gesamten GPCR-Familie zu blockieren und teilen mit dem C-Terminus des Gt ein gemeinsames E/DxLxxxGL Motiv. Es wird spekuliert, dass dieses Motiv des Arrestins in der gleichen Weise in der Bindungstasche des aktiven Rhodopsins bindet wie das Gt C-Terminus. UV-Vis-spektroskopische Bindungsmessungen von Peptiden, die aus diesem Motiv abgeleitet wurden, legen nahe, dass diese gemeinsame Sequenz tatsächlich in Arrestin als Sensor der aktivierten Rezeptoren fungiert. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Bildung des Arrestin-Komplexes mit Hilfe von Fourier-Transformations-Infrarot (FTIR) Spektroskopie untersucht. Die Messungen zeigen, dass der Übergang von initial Rezeptor gebundenem Arrestin (pre-complex) zum stabilen Arrestin/Rezeptor-Komplex (high-affinity complex) nur von geringfügigen Konformationsänderungen begleitet ist (5% Verringerung des Beta-Faltblatt-Anteils im Arrestin). Eine kinetische Auswertung dieses Übergangs deutet auf die Existenz von zwei unterschiedlichen initial gebundenen Arrestin Populationen hin, wobei eine Dimerisierung dieser Arrestin/Rezeptor-Komplexe dabei vermutlich eine wichtige Rolle spielt. Die FTIR-Messungen zeigen zudem, dass beim Zerfall des Arrestin-Komplexes eine Änderung der funktionelle Arrestin-Rhodopsin Stöchiometrie von 1:1 zu 2:1 erfolgt, wobei die eine Hälfte der Rezeptoren in einer Arrestin gebundenen, aktiven Rezeptorkonformation verbleibt, während die andere Hälfte der Rezeptoren zu inaktivem Opsin und all-trans-Retinal zerfällt. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde die Diffusion fluoreszenzmarkierter Rhodopsinmoleküle in nativen Diskmembranen mittels Einzelmolekülmikroskopie verfolgt. Die Messungen zeigen, dass etwa 80% der Rezeptoren immobil sind und ca. 20% der Rezeptoren eine geringe Mobilität (Diffusionskonstante = 0,005 μm2/s) aufweisen. Der hohe Anteil immobiler Rezeptoren und die geringe Diffusionsgeschwindigkeit der mobilen Rezeptoren unterstützen Modelle einer Organisation von Rhodopsin in Di-bzw. Oligomeren.
G protein coupled receptors (GPCRs) are transmembrane receptors responsible for sensing and transmitting signals across the plasma membrane to G proteins. Agonist binding promotes receptor interaction with G proteins, thereby initiating signal transduction. Rhodopsin serves as a model for understanding GPCRs, as previous investigations have provided detailed information on its structure and interactions. Unlike the other GPCRs, rhodopsin´s ligand, 11-cis-retinal, is already bound to the inactive dark state. Light induced cis/trans isomerisation of the retinal triggers conformational changes in the receptor leading to its activation. Before the decay of the activated receptor into the aporeceptor opsin and free all-trans-retinal, G protein activation is blocked by receptor phosphorylation and binding of arrestin. Although different crystal structures of basal and pre-active arrestin have been reported, the transition to the high affinity arrestin-receptor complex is not yet understood. The first part of this thesis explores the common sequence shared by the four arrestin types and G protein of the rod cells (Gt). The four arrestin types are responsible for blocking the signal throughout the whole GPCR family, and all contain the motif E/DxLxxxGL, also present in the Gt C-terminus. This common motif is speculated to bind the receptor crevice in the same way as the Gt C-terminus. Binding measurements using an UV-Vis spectroscopic functional assay, carried out with a peptide library derived from this common motif, suggest that this common sequence acts as the activated receptor sensor in arrestin. In the second part of this work, the formation of the arrestin complex was investigated by means of Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy. A loss of ~5% of the beta sheet content of arrestin occurs upon the transition from pre-bound arrestin (pre-complex) to the high affinity complex, arguing that a small conformational change occurs upon complex formation in arrestin. Two different binding kinetics were observed upon formation of the high affinity complex. The data thus suggest the presence of two different pre-complex populations. Furthermore, dimerization of these pre-complexes is suggested to play a major role. Half of the high affinity complex population remains stabilized in the active receptor conformation, after decay. The other half of the receptor population decays to inactive opsin. The asymmetric complex decay shifts the functional arrestin-rhodopsin stoichiometry from one-to-one to one-to-two. In the last part of this work, organization of receptors in native disc membranes was analysed by means of single molecule technique. Individually fluorescent labelled receptors were tracked with a wide-field microscope. The data show that ~80% of receptors are immobile and ~20% of receptors are mobile with a diffusion coefficient of 0,005 μm2/s. The high number of immobile receptors and the low diffusion rate of the mobile receptors support an organization of rhodopsin in dimers and/or in racks.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus4-62732
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/4643
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4346
Exam Date: 29-Jan-2015
Issue Date: 11-Feb-2015
Date Available: 11-Feb-2015
DDC Class: 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Subject(s): GPCR
Arrestin
Rhodopsin
Spektroskopie
Mikroskopie
GPCR
arrestin
rhodopsin
spectroscopy
microscopy
Usage rights: Terms of German Copyright Law
Appears in Collections:Technische Universität Berlin » Fakultäten & Zentralinstitute » Fakultät 2 Mathematik und Naturwissenschaften » Institut für Chemie » Publications

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
beyrière_florent.pdf8.26 MBAdobe PDFThumbnail
View/Open


Items in DepositOnce are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.