Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4402
Main Title: Untersuchungen zum gemeinsamen Schalten des lysosomalen Chlorid-Protonen-Austauschers ClC 7
Translated Title: Investigation of the common gate of the lysosomal chloride proton exchanger ClC 7
Author(s): Ludwig, Carmen
Advisor(s): Jentsch, Thomas J.
Referee(s): Jentsch, Thomas J.
Friedrich, Thomas
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: ClC-7 ist ein Chlorid/Protonen-Antiporter, der zusammen mit seiner β-Untereinheit Ostm1 in Lysosomen und der Resoptionslakune, welche vom Bürstensaum der Osteoklasten gebildet wird, lokalisiert. Während ClC-7 in Osteoklasten für die Aufrechterhaltung eines sauren pH-Wertes der Resorptionslakune notwendig ist, ist seine Funktion in Lysosomen noch nicht vollständig verstanden. ClC-7 scheint hier eine wichtige Rolle für die Akkumulation von Chloridionen zu spielen. Die physiologische Bedeutung von ClC-7 wird verdeutlicht durch den Phänotyp der ClC-7 Knockout Maus. Dieser ist gekennzeichnet von schwerer Osteopetrose, der Degeneration der Retina und der CA3-Region des Hippocampus. Des Weiteren sind etwa 50 Mutationen im Menschen bekannt, die mit der Entstehung von dominanter oder rezessiver humaner Osteopetrose unterschiedlicher Schweregrade in Verbindung gebracht werden. Mit Hilfe von Mutationen, die eine partielle Lokalisation von ClC-7 an der Plasmamembran hervorriefen, gelang erstmals eine elektrophysiologische Charakterisierung von ClC-7. Diese zeigte, dass ClC-7 ein langsam aktivierter, auswärts rektifizierender 2Cl-/1H+-Austauscher ist. Während ClC-7 einige Merkmale wie z.B. die Ionenselektivität, die Stöchiometrie oder die starke Rektifizierung mit anderen CLC's teilt, ist die langsame Aktivierung einzigartig unter den intrazellulären CLC's. Im Rahmen dieser Arbeit wurde erstmalig eine Charakterisierung der Auswirkung der humanen Mutationen auf ClC-7 vorgenommen. Dabei zeigte sich, dass neben einer Reihe von Mutationen, welche zu einem Funktionsverlust des Proteins führen, viele Mutationen das Schaltverhalten (gating) von ClC-7 beschleunigen. Diese Mutationen befinden sich mehrheitlich an der Interaktionsfläche zwischen Transmembrandomäne und zweiter CBS-Domäne. „Schnelle“ Mutationen sind in der Lage, in Heterodimeren auch das gating der Wildtyp-Untereinheit zu beschleunigen. Sie beeinflussen also das common gating von ClC-7, welches der langsamen Aktivierung zu Grunde liegt. Die Existenz eines common gating-Prozesses war bis jetzt nur für ClC-0, ClC-1 und ClC-2 bekannt; ClC-7 ist damit das erste intrazelluläre CLC, für das das Vorhandensein eines common gates gezeigt wurde. Die molekulare Identität des äußeren gates ist in ClC-7, wie auch in allen anderen CLC's, das gating-Glutamat. Welcher Teil des Proteins das innere gate der CLC-Transporter darstellt, ist noch nicht abschließend geklärt. Es wird aber vermutet, dass das Chlorid-koordinierende Tyrosin, ein hochkonservierter Rest der Pore, das innere gate von EcClC-1, einem CLC-Transporter aus E. coli, bildet. Mit Hilfe der Bestimmung des Umkehrpotentials konnte nun gezeigt werden, dass in ClC-7 Mutationen dieses Tyrosins den Chlorid/Protonen-Antiport nicht entkoppeln. Somit ist das Chlorid-koordinierende Tyrosin nicht das innere gate von ClC-7, sondern scheint vielmehr ebenfalls eine wichtige Rolle für das gating zu spielen.
ClC-7, a chloride/proton antiporter, localizes to lysosomes and to the ruffled border of osteoclasts together with its β-subunit Ostm1. While it is widely accepted that ClC-7 is necessary for the acidification of the resorption lacuna in osteoclasts, its role in the physiology of lysosomes is not well understood. Apparently, the function of ClC-7 in these organelles lies in chloride accumulation rather than pH regulation. The phenotype of ClC-7 knockout mice, that suffer from severe osteopetrosis, degeneration of the retina and the CA3 region of the hippocampus, emphasizes the physiological importance of ClC-7. Around 50 mutations in humans are known to cause recessive or dominant osteopetrosis of varying severity. Recently, the first electrophysiological characterization of ClC-7 that made use of a sorting mutant that partially localizes to the plasma membrane, showed that ClC-7 is a slowly activated, outwardly rectifying 2Cl-/1H+ exchanger. While ClC-7 shares some of the features like ion selectivity, stoichiometry and strong rectification with other CLC’s, its slow activation is unique among the intracellular CLC’s. Within the scope of this thesis the first characterization of effects of mutations related to human osteopetrosis has been performed. Some mutations resulted in loss-of-function while others accelerated the slow gating of ClC-7. These mutations mostly localize to the interface between transmembrane domain and second CBS domain and are able to accelerate gating in trans if present in a homodimer consisting of a mutant and a wildtype subunit. This reveals that common gating underlies the slow activation of ClC-7. So far, the existence of a common gate was only known for ClC-0, ClC-1 and ClC-2. ClC-7 is the first intracellular CLC that has been proven to show common gating as well. While it is widely accepted that the molecular identity of the outer gate is constituted by the gating-glutamate, it is still unclear which part of the protein forms the inner gate of CLC transporters. In this respect, a highly conserved tyrosine residue inside the pore that has a role in coordinating the central chloride ion has been discussed. However, experiments that led to this conclusion employed the bacterial transporter EcClC-1. Reversal potential measurements of two mutants of this residue in ClC-7 contradict this hypothesis, as these mutant proteins still appear to be coupled chloride/proton antiporters. Rather than being part of the inner gate, the tyrosine seems to play an important role for voltage dependent gating as well.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus4-64941
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/4699
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4402
Exam Date: 9-Mar-2015
Issue Date: 13-May-2015
Date Available: 13-May-2015
DDC Class: 572 Biochemie
Subject(s): Ionentransporter
Schaltverhalten
Osteopetrose
Ion transporter
gating
osteopetrosis
Creative Commons License: https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/de/
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