Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4405
Main Title: Etablierung eines Teratommodells von murinen embryonalen Stammzellen zur Prüfung von Substanzen auf Embryotoxizität
Translated Title: Establishment of a teratoma model with murine embryonic stem cells for testing the embryotoxicity of drugs
Author(s): Stecklum, Maria
Referee(s): Lauster, Roland
Fichtner, Iduna
Kurreck, Jens
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Embryonale Stammzellen werden auf verschiedensten Gebieten der regenerativen Medizin als Hoffnungsträger für zellbasierte Therapien für eine Vielzahl von Krankheiten angesehen. Des Weiteren finden sie im Rahmen der medizinischen Forschung im Bereich der Entwicklungsbiologie, Embryotoxikologie und Pharmakologie vielseitig Anwendung und werden in diesem Zusammenhang als Modellsysteme eingesetzt. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Etablierung eines Teratommodells aus murinen embryonalen Stammzellen, das einerseits zur Beurteilung der Qualität von Stammzellpräparaten dienen und andererseits für die Entwicklung eines neuen Embryotoxizitätstestsystem genutzt werden sollte. Verschiedene Parameter der Zellkultivierung bzw. der Teratombildung in der NOD/SCID-Maus (Zellzahl, Probenahmezeitpunkt, Markerprofil, Applikationsroute, Biolumineszenz) wurden untersucht. Durch die Analyse des Expressionsprofils auf RNA- und Proteinebene sowie histopathologische Bewertungen und Biolumineszenzanalysen wurden das in vitro und in vivo Verhalten der embryonalen Stammzelllen (7AC5) charakterisiert und die Einwirkung von Referenzsubstanzen mit embryotoxischem Potenzial bestimmt. Es wurden folgende Ergebnisse generiert. 1. Murine embryonale 7AC5/EYFP-Stammzellen verhalten sich hinsichtlich Wachstumseigenschaften unter feeder- und serumfreien (7AC5/FF) Kultivierungsbedingungen vergleichbar zur Standardkultur auf Feederzellen (7AC5/MEF). Die 7AC5/FF- und 7AC5/MEF-Stammzellen sind durch eine hohe Expression der Pluripotenzmarker (Oct-3,4, Nanog, Sox2) gekennzeichnet. Nur der Pluripotenzmarker SSEA-1 ist auf 7AC5/FF-Stammzellen signifikant schwächer exprimiert. Jedoch hat die verminderte Expression von SSEA-1 keinen direkten Einfluss auf den pluripotenten Charakter der Zellen. In vivo sind 7AC5-Stammzellen durch ein vergleichbares Differenzierungspotenzial und Teratombildungsrate wie 7AC5/MEF-Stammzellen gekennzeichnet. 2. 7AC5/FF-Stammzellen wurden durch Nukleofektion mit einem Luciferaseplasmid als Reportergen stabil transfiziert. Die transfizierten Zellen (7AC5/Luc) zeigen vergleichbare Wachstumseigenschaften zu nicht-transfizierten Zellen in vitro und in vivo. Durch die Integration des Luciferaseplasmids in das Zellgenom ist eine semiquantitative Charakterisierung des Engraftmentpotenzials möglich. Nach der Applikation über unterschiedliche systemische und organspezifische Transplantationsrouten in NOD/SCID-Mäuse wurde die Teratombildungsrate in Abhängigkeit von der Zellzahl detailliert untersucht. Es zeigte sich eine zeitlich verzögerte Teratombildungsrate mit abnehmender Zellzahl, die unter anderem durch die Transplantationsroute beeinflussbar war. Die 7AC5-abgeleiteten Teratome wiesen jedoch, unabhängig von den experimentell untersuchten Parametern und Transplantationsbedingungen, ein vergleichbares Differenzierungspotenzial in vivo sowie ein charakteristisches Expressionsprofil auf. Durch die stabile Integration eines Luciferaseplasmids wurde eine duale Reportergen-tragende Stammzelllinie (EYFP- und Luc-Gen) etabliert, deren Zelleigenschaften in vitro, in vivo und ex vivo detektiert werden kann. 3. Zur Etablierung des Embryotoxizitätstestsystems wurde die embryotoxische Wirkung von verschiedenen Referenzsubstanzen aus drei Embryotoxizitätsklassen in vitro (zwei Substanzen je Klasse) und in vivo (eine Substanzen je Klasse) an 7AC5-Stammzellen untersucht. Die bestimmten IC50-Werte ermöglichten eine erste in vitro Klassifizierung der untersuchten Substanzen nach ihrem embryotoxischen Potenzial, sodass Saccharose und Coffein als nicht embryotoxische, Dexamethason und Valproinsäure als schwache und 6-AN und 5-FU als stark embryotoxische Substanzen eingeordnet werden konnten. Zur weiteren Charakterisierung wurden in vivo Studien an NOD/SCID-Mäusen mit Saccharose, VPA und 5-FU durchgeführt. Durch die Substanzbehandlung wurde das Teratomwachstum entsprechend der Embryotoxizitätsklasse nicht, moderat bzw. stark gehemmt. Die Behandlung mit der stark embryotoxischen Substanz 5-FU verminderte signifikant die Teratomentwicklung. Außerdem wurde die Vielfältigkeit der Keimblattstruktur in den stammzellabgeleiteten Teratomen negativ beeinflusst. Im Expressionsprofil konnte mittels des untersuchten Markerpanels von Pluripotenz- und Differenzierungsmarkern nur bei der stark embryotoxischen Substanz 5-FU in vitro und in vivo partielle Unterschiede nachgewiesen werden. Das im Rahmen dieser Arbeit etablierte Teratommodell von 7AC5-Stammzellen in der NOD/SCID-Maus kann unter Verwendung von in vivo live Imaging Methoden (Biolumineszenz) genutzt werden, um die Organverteilung, das Engraftment- und Differenzierungspotenzial von embryonalen Stammzellen zu untersuchen. Des Weiteren ist eine Klassifizierung von neuen Substanzen nach ihrem embryotoxischen Potenzial möglich. Durch Verwendung von humanen embryonalen bzw. induziert pluripotenten Stammzellen zur Teratombildung ist die Etablierung eines humanisierten Testsystems zur Substanztestung in der Maus möglich.
Embryonic stem cells are a promising tool for cell-based therapies in many fields of regenerative medicine. Furthermore, they play an important role as a model system and research tool for developmental biology, embryotoxicology and pharmacology. The present work is engaged in the establishment of a teratoma model with murine embryonic stem cells, which can be used on the one hand for the quality assessment of stem cell sources and on the other hand for the development of a new embryotoxicity test system. Different cultivation conditions and the teratoma model (cell number, time point of sample collection, marker profile, application routes, bioluminescence) were characterized. Analyzing the expression profile on RNA and proteine level, histopathological assessment of the samples and bioluminescene studies were used to determine the in vitro and in vivo behaviour of the murine embryonic 7AC5 stem cell line and the influence of reference drugs with embryotoxic potential on these characteristics. Folllowing results were achieved: 1. Murine embryonic 7AC5/EYFP stem cells are characterized by a comparable morphology under feeder- and serum-free conditions (7AC5/FF) due to the standard cultivation on feeder cells (7AC5/MEF). 7AC5/FF and 7AC5/MEF stem cells express characteristic pluripotency markers (Oct-4, Nanog and Sox2) on a high level. In contrast, SSEA-1 as a distinctive marker for pluripotency of murine embryonic stem cells is significantly lower expressed in 7AC5/FF stem cells in comparison to 7AC5/MEF stem cells. However, the lower SSEA-1 expression in 7AC5/FF stem cells seems to have no influence on the pluripotent character of the stem cell line. In vivo 7AC5/FF and 7AC5/MEF stem cells are characterized by a comparable differentiation potential, teratoma growth and development. 2. 7AC5/FF stem cells were stable transfected with a Luciferase plasmid as a reporter gene. Transfected stem cells (7AC5/Luc) show a comparable in vitro and in vivo behaviour like non-transfected 7AC5 stem cells. A semiquantitative determination of the engraftment potential was possible after the integration of the luciferase plasmid in the genome of 7AC5 stem cells. After application of these cells through different systemic and organ specific transplantations routes teratoma growth was investigated in dependent of the cell number. Teratoma development was delayed in time after application of decreasing cell numbers, which was influenced in addition by the transplantation route. However, stem cell derived teratomas are characterized by a comparable teratoma growth, differentiation potential and a distinctive expression profile independent from the investigated experimental parameters and transplantation routes. By the integration of the luciferase plasmid a dual reporter gene stem cell line (EYFP and Luc gene) was established, whose in vitro, in vivo and ex vivo cell properties can be detected by the analysis of these two reporter genes. 3. For the establishment of the embryotoxic test system with 7AC5 stem cells were investigated in vitro (two drugs per group) and in vivo (one drug per group) concerning their sensitivity towards reference drugs with different embryotoxic potential (non, weak, strong). By the determination of the IC50 values of the investigated drugs in vitro a first classification could be conducted. Saccharose and Caffeine were disposed as non embryotoxic, VPA and Dexamethason as weak embryotoxic and 5-FU and 6-AN as strong embryotoxic. For further characterization in vivo studies with NOD/SCID mice were performed with Saccharose, VPA and 5-FU. Teratoma growth was not, weak or strong inhibited by the treatment with these three drugs according to their embryotoxic potential. Treatment with 5-FU as a strong embryotoxic drug significantly decreased teratoma growth. Furthermore, the differential variability of the germ layer structures of teratomas was negatively influenced by the treatment. Expression profile of 5-FU treated 7AC5 stem cells and derived teratomas identified partial differences of investigated pluripotency and differentiation markers. In conclusion, the established teratoma model of 7AC5 stem cells in NOD/SCID mice and the application of live imaging methods (bioluminescence) can be used to determine the organ distribution, engraftment and differentiation potential of embryonic stem cells in vivo. In addition, classification of the embryotoxic potential of new drugs is possible. Using human embryonic or induced pluripotent stem cells for the teratoma model the establishment of a humanized test system in the mouse for embryotoxic drug testing is possible.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus4-64997
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/4702
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4405
Exam Date: 19-Dec-2014
Issue Date: 28-Apr-2015
Date Available: 28-Apr-2015
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): Biolumineszenz
Embryotoxizität
Murine embryonale Stammzellen
Teratom
Bioluminescence
Embryotoxicity
Murine embryonic stem cells
Teratoma
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