Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4431
Main Title: Vibrational spectroscopy of phytochromes and phytochrome-related photoreceptors
Translated Title: Schwingungsspektroskopische Untersuchung an Phytochromen und Phytochromo-verwandten Photorezeptoren
Espectroscopía vibracional de fitocromos y foto receptores relacionados
Author(s): Velázquez Escobar, Francisco Javier
Advisor(s): Hildebrandt, Peter
Referee(s): Gärtner, Wolfgang
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: In dieser Arbeit wurde ein integrierter schwingungsspektroskopischer Ansatz zur Untersuchung der Mechanismen der Licht-induzierten Prozesse in Phytochromen angewandt. Diese Photorezeptor-Proteine binden ein offenkettiges Tetrapyrrol als Cofaktor. Hauptsächlich als kanonische (Pflanzen), prototypische (Bakterien, Pilze), Bathy-Phytochrome (Bakterien) und Cyanobakteriochrome (Cyanobakterien) klassifiziert, regulieren Phytochrome diverse biologische Prozesse (z. B. Blühverhalten, Phototaxis und Pigment-Synthese). In drei verschiedenen prototypischen Bakteriophytochromen (Agp1, CphB und Rph2) wurden die Chromophor-Strukturänderungen im Laufe des Übergangs vom dunkel-adaptierten (Pr) zum Licht-induzierten Zustand (Pfr) mittels (pre-)Resonanz-Raman (RR) Spektroskopie charakterisiert, die die selektive Chromophor-Banden-Verstärkung gegenüber der Proteinmatrix ermöglicht. Dabei wurde ein allgemeines Temperatur-abhängiges Reaktionsmuster für Pr-zu-Pfr Übergang identifiziert. Die Reaktionsfolge umfasst die Z/E- Isomerisierung (Lumi-R), den Kooplanaritätsverlust (Meta-Ra) und die transiente Deprotonierung des Chromophors (Meta-Rc). Eine spezifische Protein-Faltungsänderung führt endgültig zum Pfr-Zustand. Die Protein-β- Faltblatt-Helikalisierung wurde mittels Infrarot (IR) Spektroskopie bestimmt und ist in Übereinstimmung mit publizierten kristallografischen Daten. Die RR Pfr Spektrenanalyse erlaubte die Zuordnung von Chromophor-Konformationsheterogenitäten (ZZE) bei prototypischen Phytochromen jenseits der kristallographischen Auflösung. Die Flexibilität an der AB und CD Methinbrücken des Chromophors ist mutmaßlich mit der Deaktivierung des Pfr-Zustands gekoppelt. Im Gegensatz dazu nimmt der Cofaktor eine homogene Struktur im dunkel-adaptierten Pfr-Zustand der Bathy-Phytochrome (Agp2, Pap1) ein. Offensichtlich zwingt die starke Wasserstoffbrückenbindung zwischen der Asp194 Seitenkette und dem Ring D den Cofaktor in eine definierte Geometrie. Dies wurde durch QM/MM-Rechnungen vorausgesagt und experimentell auf Grund des äußerst langsamen Pyrrol-Stickstoff Protonen-Austausches am ring D des Chromophors bestätigt. Bei den Bathy-Phytochromen sind die Deprotonierung einer Propionsäurenkette des Chromophors und die Strukturänderung der PHY-Domäne (α-Helix-zu-β-Faltblatt) zur Bildung des Licht-aktivierten Pr-Zustandes notwendig. Die (De)aktivierung des Signalmoduls erfolgt über den thermischen Zerfall des Pr-Zustands. Dieser basiert auf der Keto-Enol-Tautomerie am Ring D, welche durch das Säure-Base Gleichgewicht an der benachbarten HisH278 moduliert wird. Dieser Keto-Enol-gesteuertes Mechanismus bildet wahrscheinlich ganz den entscheidenden Schritt für den thermischen Zerfall Licht-aktivierte Zustände auch bei prototypischen Phytochromen (Pfr-zu-Pr) sowie bei Cyanobakteriochromen dar. Die Chromophor-Heterogenität im Pr-Zustand von Cph1 Phytochrom wird durch den Protonierungszustand am konservierten His260 gesteuert. Dies wurde an Hand von RR Spektroskopie an Cph1-Varianten, inklusive Chromophor-Isotopomeren und His260-Substitution ermittelt. Weiterhin spielt diese Aminosäure eine wesentliche Rolle während der Chromophor-Reprotonierung im Pfr-Zustand. Gemäß den RR Spektren, nimmt der Chromophor im dunkel-adaptierten Pr-Zustand des rot/grün-Cyanobakteriochroms ApxJ dieselbe ZZZ-Konformation wie in kanonischen Phytochromen. Die Licht-induzierte Form zeigt eine ähnliche protonierte ZZE-Geometrie wie im Pfr-Zustand. Allerdings ändert die Hydratisierung der Bindungstasche die elektronische Chromophor-Struktur, welches zu einer Blauverschiebung des ersten angeregten Zustandes und der Methin-Streckschwingungsmoden (Pg-Zustand) führt. Wasserzutritt wird durch Trp90 vermittelt, wie von Molekulardynamik-Simulationen vorhergesagt wurde. Die strukturelle Flexibilität am Ring A und D sowie die Wasserstoffbrückenbindung der terminalen C=O Gruppen steuern in der Rph2-Chromophorbindungsdomänen das Verhältnis zwischen photochemischer Konversion und Fluoreszenz. Veränderungen dieser Parameter mittels spezifischer und zufälliger Mutagenese kann an Handder Markerbanden im RR Spektrum detektiert werden, was das Design Infrarot-fluoreszierender Phytochrom-Varianten für künftige in-vivo Fluoreszenz-Mikrokopie-Anwendungen leiten kann.
In the present work an integral vibrational spectroscopic approach was applied to investigate the mechanisms of the photoinduced processes in phytochromes. These photoreceptor proteins bind an open-chain tetrapyrrole as a cofactor. Mainly classified in canonical (plants), prototypical (bacteria, fungi), bathy phytochromes (bacteria) and cyanobacteriochromes (cyanobacteria), they regulate diverse biological processes (e.g flowering, phototaxis and pigment expression). The chromophore structural changes during the transition from the dark adapted (Pr) to the light-induced state (Pfr) in three different prototypical bacterio-phytochromes (Agp1, CphB and Rph2) were characterized employing (pre-)Resonance Raman (RR) spectroscopy, thus selectively probing chromophore bands over the protein matrix. A common unidirectional temperature-dependent Pr-to-Pfr reaction pathway was identified. This reaction sequence involves the chromophore Z/E-isomerization (Lumi-R), the loss of bilin coplanarity (Meta-Ra) and a transient deprotonation, (Meta-Rc), followed by protein refolding which eventually leads to Pfr state formation. The last step involves a β-sheet-to-α-helix transition, as determined by infrared (IR) spectroscopy in line with published crystallographic data. Band analysis of the RR spectra of Pfr in prototypical phytochromes allowed the identification of conformational heterogeneities of the chromophore (ZZE) –which are beyond the resolution of protein crystallography. The bilin flexibility at the AB and CD methine bridge is presumably associated with the thermal Pfr-deactivation pathway. In contrast, the chromophore in the dark-adapted Pfr state of bathy phytochromes (Agp2, Pap1) adopts a homogeneous structure, most likely due to the strong hydrogen bonding with the side chain of an adjacent Asp194 residue forces the bilin cofactor into a defined geometry. Hydrogen bond interaction and accurate geometry were predicted by QM/MM calculations and experimentally validated by the extremely slow pyrrole-nitrogen proton exchange at the bilin ring D. Formation of the light-activated Pr-state in bathy phytochromes involves the deprotonation of the bilin propionic side chain and α-helix-to-β-sheet refolding in the PHY-tongue. Output module (de)activation via the thermal decay of the Pr state is based on a keto-enol tautomerism at the terminal ring D, modulated by an acid-based equilibrium of the nearby His278. This keto-enol controlled mechanism is likely to represent a general decay mechanism of the light-activated states also in prototypical phytochromes (Pfr-to-Pr) and cyanobacteriochromes. Within the Pr state of Cph1 phytochrome, the chromophore heterogeneity is controlled by the protonation state of the conserved His260, as determined by RR spectroscopy of Cph1 variants including chromophore isotopomers and His260 substitution. This residue plays a crucial role during the chromophore reprotonation in the Pfr state. According to the RR spectra, the dark adapted Pr state of red/green ApxJ cyanobacteriochrome adopts the same ZZZ-chromophore-conformation as in canonical phytochromes. The light-activated form also displays a similar protonated ZZE-geometry as Pfr; however the electronic structure is altered by an increased hydration of the chromophore pocket, leading to a blue shift of the first electronic transition and of the methine bridge stretching modes (Pg state). Water influx is mediated by Trp90 as predicted by molecular dynamics simulations. The structural flexibility at the rings A and D as well as hydrogen bonding of the terminal C=O groups control the interplay between photochemical conversion and fluorescence in the Rph2 chromophore binding domain. Alteration of these parameters via site-directed and random mutagenesis is reflected by marker bands in the RR spectrum. Thus, RR spectroscopy may guide the design of infrared fluorescent phytochrome variants for future applications for in-vivo fluorescence microscopy.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus4-65549
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/4728
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4431
Exam Date: 18-Mar-2015
Issue Date: 7-Jul-2015
Date Available: 7-Jul-2015
DDC Class: 500 Naturwissenschaften und Mathematik
Subject(s): Phytochrom, Cyanobacteriochrom, Schwingungsspektroskopie, Resonanz Raman, Infrarot- Spektroskopie, biologische Photorezeptoren, bipohysikalische Chemie, Biophysik
Phytochrome, cyanobacteriochrome, vibrational spectroscopy, Resonance Raman, Infrared spectroscopy, biological photoreceptors, biophysical chemistry, biophysics
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