Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4465
Main Title: High-content analysis approach for phenotypic screening and characterization of histone H3 Lys27 trimethylation modulation in cancer cells
Translated Title: Automatisiertes Mikroskopieverfahren (High-Content Analyse) zur phänotypischen Charakterisierung und dem Screening von Modulationen der Trimethylierung des Lysins an Position 27 des Histon 3 in Krebszelllinien
Author(s): Lünse, Svenja
Advisor(s): Prechtl, Stefan
Lauster, Roland
Referee(s): Lauster, Roland
Haendler, Bernard
Rappsilber, Juri
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Die Inhibition von EZH2 führt zu einem Abfall an globalem H3K27me3 Level und gleichzeitig zu einer Reaktivierung von zuvor herrunterregulierten Tumorsuppressorgenen. Daher stellen EZH2 und die repressive Modifikation H3K27me3 einen potentiellen Angriffspunkt in der Krebstherapie dar. In dieser Arbeit wurde ein HCA Assay zur Charakterisierung von chemischen Inhibitoren von EZH2 und anderen Histonmethyltransferasen etabliert und angewendet. Der phenotypische Assay wurde mittels Transfektion von siRNA und der Behandlung verschiedener chemischer Inhibitoren etabliert und validiert. Eine beschriebene Reduktion von H3K9me2 durch Inhibition von G9a/GLP1 und von H3K27me3 durch Inhibition oder Herunterregulation von EZH2 konnte gezeigt werden. Basierend auf einer siRNA Transfektionsanalyse verschiedener Histonmethyltransferasen wurde EZH2 als Enzym zur Entwicklung des Assays und einer anschließenden Untersuchung der Modulation von H3K27me3 durch EZH2 Inhibitoren ausgewählt. Die Robustheit und Reproduzierbarkeit des Assays ermöglichen dessen Eignung zum Screening großer Substanzbibliotheken. Verschiedene EZH2 Inhibitoren wurden mit Hilfe des Assays untersucht und gegenübergestellt. Inhibitor Effekte wurden auf der Einzelzellebene über einen breiten Konzentrationsbereich durch das gleichzeitige Ermitteln der Kernmorphologie und der Signalintensität modifikationsspezifischer Antikörper bestimmt. Eine Reduktion von H3K27me3 führte zu einer nahezu symmetrischen Zunahme an H3K27ac. Die parallele Quantifizierung der antagonistischen Modifikation H3K27ac und auch weiterer Histonmodifikationen stellen eine geeignete Dualauslesung des Assays dar. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass zum einen eine Inhibition einer de novo H3K27 Methylation und zum anderen ein dynamischer, zellzyklusunabhängiger H3K27me3 Umsatz eine Reduktion des globalen H3K27me3 Levels bewirkt. Ein messbarer Beitrag der H3K27-demethylasen, UTX und JMJD3, konnte am Umsatz von H3K27me3 aufgezeigt werden. Darüber hinaus konnte eine Reversibilität der H3K27me3 Modulation gezeigt werden, auf der globalen Ebene aber auch auf dem Level der Expression verschiedener Polycomb-regulierter Zielgene (HOXC8, IFI27, POU5F1 (Oct-4), SLIT, SOX2 und TNFRSF21). Zusammenfassend ermöglicht der in dieser Arbeit etablierte EZH2 HCA Assay eine zelluläre und mechanistische Charakterisierung von möglichen EZH2 Inhibitoren. Die Robustheit und Reproduzierbarkeit des Assays ermöglicht ein Screening großer Substanzbibliotheken nach Molekülen mit EZH2-inhibierenden Eigenschaften. Zusammen mit den bereits entdeckten selektiven EZH2 Inhibitoren bietet der EZH2 HCA Assay außerdem eine geeignete und aussagekräftige Methode zur Untersuchung von H3K27me3 und EZH2 in der Zelle.
It has been shown that the inhibition of EZH2 is able to decrease global levels of the repressive mark H3K27me3, and thereby, reactivates silenced tumor suppressor genes such as TNFRSF21, TXNIP in sensitive cell lines. Thus, EZH2 forms an exciting potentially drug target in cancer. In this work, a HCA assay for the cell-based monitoring of small-molecule inhibition of EZH2 was established and applied. The phenotypic assay was established and validated by the use of siRNA and small-molecule inhibitors, confirming previous observations associated with global reduction in H3K9me2 after inhibition of G9a/GLP1 or global reduction in H3K27me3 after EZH2 inhibition or depletion. Based on siRNA-mediated knockdown analysis targeting different HKMTs, EZH2 was picked as the target enzyme of choice for an HCA assay development and a subsequent investigation of the functionality of induced H3K27me3 suppression. The assay consistency and reproducibility qualified the assay to be fit for screening of large compound libraries. Different EZH2 inhibitors were characterized and benchmarked distinguishing selective and cellular active EZH2 inhibition from indirect EZH2 inhibition with concomitant proliferative effect, or from inhibition with non-effectual cellular potency. Through simultaneously encompassing relevant cellular processes (e.g. nuclear morphology together with the measurement of the signal intensity of the site-specific histone modification antibody), inhibitor effects were monitored over broad inhibitor concentration ranges on the physiology of single cells. A loss of histone H3K27me3 loci triggered a symmetrical increase of the H3K27 acetylation mark. The demonstrated ability to analyze the genome-wide modification shift from H3K27me3 to H3K27ac as well as different histone marks in parallel (in form of multiplexed assays) formed appropriate dual-readouts to monitor small-molecule EZH2 inhibitors. A loss in global H3K27me3, induced by EZH2 inhibition, was shown to comprise two distinct mechanisms: the inhibition of de novo methylation establishment, and a dynamic, replication independent, H3K27me3 turnover. Moreover, a measurable contribution of the two known H3K27-demethylases, UTX and JMJD3, on the turnover of H3K27me3 was demonstrated. Finally, full reversibility of the inhibitor treatment was observed, which was demonstrated at the global level of H3K27me3 but also at the level of gene expression of a set of Polycomb regulated target genes (HOXC8, IFI27, POU5F1 (Oct-4), SLIT, SOX2 and TNFRSF21). Altogether, the established EZH2 HCA assay enables a phenotypic and mechanistic characterization of compounds, possibly inhibiting EZH2, with high informational value (e.g. cellular downstream and morphological effects via multiplexing or heterogenic effects through the analysis of single nuclei). The assay demonstrated high quality and reproducibility sufficient for screening of large compound libraries. Complementing recent discoveries of selective tool inhibitors targeting EZH2, the assay moreover represents a useful tool for the cellular investigation of H3K27me3 and EZH2 biology.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus4-66368
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/4762
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4465
Exam Date: 11-Jul-2014
Issue Date: 25-Jun-2015
Date Available: 25-Jun-2015
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): Automatisierte Mikroskopie
Histon-Methyltransferase
Chromatinmodulatoren
High-content analysis
Histone methyltransferase
Chromatin modulators
Creative Commons License: https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/de/
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