Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4473
Main Title: Rationales Design von antimikrobiellen Peptiden für die therapeutische Anwendung und Entwicklung von Peptid-basierten antimikrobiellen Oberflächenbeschichtungen
Translated Title: Rational design of antimicrobial peptides for therapeutic application and development of peptide-based antimicrobial surface coatings
Author(s): Rapsch, Karsten
Advisor(s): Neubauer, Peter
Referee(s): Bier, Frank F.
Neubauer, Peter
Meyer, Vera
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: In den vergangenen Jahren haben sich, aufgrund des intensiven Einsatzes von Antibiotika, eine Vielzahl von resistenten Bakterien entwickelt, zu welchen unter anderem MRSA, als auch ESBL exprimierende Enterobacteriacea gehören. Aus diesem Grund wurde die Entwicklung von alternativen antimikrobiell wirksamen Stoffen intensiviert, wobei jedoch nur wenige neue Agenzien entwickelt werden konnten. Eine der aussichtsreichsten Alternativen für die Entwicklung neuer Substanzen, stellen antimikrobielle Peptide dar, welche jedoch je nach Sequenz auch zytotoxische Eigenschaften aufweisen können und somit für eine therapeutische Applikation nur begrenzt einsetzbar sind. Weiterhin verfügen sie oftmals über schlechte pharmakokinetische Eigenschaften, wodurch ihre potentielle Anwendung limitiert ist. Aufgrund dieser Aspekte ist es erstrebenswert neuartige Peptide mit optimierten Eigenschaften, wie z. B. antimikrobieller Aktivität, biologischer Kompatibilität oder proteolytischer Stabilität, zu entwickeln. Zu diesem Zweck wurde hier ein rationales Design von neuartigen antimikrobiellen Peptiden mit einzigartigen Primär- und Sekundärstrukturen durchgeführt. Unter Verwendung verschiedener Peptidbibliotheken wurde diese Sequenz hinsichtlich ihrer antimikrobiellen, zytotoxischen und Membran-permeabilisierenden Eigenschaften analysiert und mit bereits bekannten und gut untersuchten antimikrobiellen Peptiden verglichen. Weiterhin wurden mittels mehrerer Peptidbibliotheken Optimierungen der artifiziellen Peptide bezüglich ihrer essenziellen Regionen, minimalen Sequenzlänge und Peptidkomposition durchgeführt. Hieraus konnte eine optimierte Sequenz abgeleitet werden, welche sich durch starke antimikrobielle und biologisch kompatible Eigenschaften auszeichnete. Während den Analysen konnte ebenfalls nachgewiesen werden, dass die antimikrobiellen Aktivitäten dieser Peptide im Allgemeinen mit den charakteristischen dreidimensionalen Peptidkonformationen einhergingen. Hierbei wurde verifiziert, dass diese Peptide über ein beta-Strang-Motiv verfügten, welches keine Übereinstimmungen mit früheren identifizierten antimikrobiell wirksamen Konformationen besaß und somit ein neuartiges Motiv repräsentierte. Für die Optimierung der strukturellen Eigenschaften wurde ebenfalls eine C-terminale Amidierung durchgeführt. Hierdurch konnte eine elektrostatische, peptidinterne Interaktion zwischen den kationischen Aminosäuren und dem C-Terminus verhindert werden, was in einer Stabilisierung der Peptidkonformation und somit in einer Steigerung der antimikrobiellen Eigenschaften resultierte. Außerdem konnte somit eine unnatürliche Modifikation in die Peptidsequenz integriert werden, welche die proteolytische Stabilität von Peptiden maßgeblich erhöht. Demzufolge konnten durch den Optimierungsprozess zwei artifizielle Peptide entwickelt werden, welche über starke antimikrobielle Eigenschaften, biologische Kompatibilitäten und eine einzigartige charakteristische Sekundärstruktur verfügen und somit vielversprechende Wirkstoffe für eine therapeutische oder industrielle Applikation darstellen. Außerdem zeigen diese Ergebnisse den Einfluss der dreidimensionalen Struktur auf die antimikrobielle Aktivität, wobei es sich bei dem identifizierten Sekundärstrukturmotiv um eine neuartige biologisch aktive Konformation handelt. Diese Struktur stellt eine hohe Relevanz für die in silico Generierung von antimikrobiellen artifiziellen Peptiden dar und eignet sich deshalb als Leitsequenz für weitere Entwicklungen. Außerdem ergänzt das identifizierte Beta-Strang-Motiv die bereits bestehenden aktiven Peptidkonformationen antimikrobieller Peptide, wodurch es in weiterführenden Grundlagenforschungen bezüglich des Wirkmechanismus antimikrobieller Peptide von fundamentaler Bedeutung sein könnte. Obendrein zeichnen sich diese Peptide durch kurze Sequenzlängen und einfache Aminosäureabfolgen aus, welche sich positiv auf die Produktionskosten auswirken. Neben der direkten Therapie ist für das humane Gesundheitswesen insbesondere die Verbreitungskontrolle und Prävention vor bakteriellen Infektionen und Kontaminationen von entscheidender Bedeutung. Aufgrund der Tatsache, dass Bakterien in der Lage sind feste Oberflächen langfristig besiedeln zu können stellen kontaminierte Oberflächen ein beträchtliches Reservoir für die Entwicklung von Biofilmen und die weitere Verbreitung von Bakterien dar. Um einen präventiven Schutz vor bakteriellen Oberflächenkontaminationen zu gewährleisten, wurden zwei verschiedene Peptid-basierte antimikrobielle Oberflächenbeschichtungen generiert. Die Analyse der mittels kovalenter Immobilisierung der Peptide generierten Modifikationen ergab, dass das verwendete Peptid und sein charakteristischer Wirkmechanismus einen der bedeutendsten Parameter bei der Entwicklung von kovalenten antimikrobiellen Oberflächenbeschichtungen darstellen. Die Untersuchungen ließen auch erkennen, dass verschiedene chemische Ligationen zu unterschiedlichen Aktivitäten der antimikrobiellen Oberflächenbeschichtungen führten. Basierend auf diesen Parametern konnten optimierte kovalente Oberflächenmodifikationen generiert werden, welche sich durch maximierte antimikrobielle Aktivitäten, minimierte Peptidmengen und biologisch kompatible Eigenschaften auszeichneten, was ein breites Einsatzgebiet im industriellen oder klinischen Sektor ermöglicht. Als Alternative dazu wurden Oberflächenmodifikationen konstruiert, welche eine elektrostatische Anlagerung von kationischen antimikrobiellen Peptiden in Kombination mit einer sukzessiven Freisetzung ermöglichten. Hierbei wurde ersichtlich, dass die Abgabedauer des antimikrobiellen Peptids abhängig von der Komplexität und der Elektronegativität der Oberflächenmodifikation war, weshalb mittels einer optimierten Beschichtung langanhaltende antimikrobielle Aktivitäten gewährleistet werden konnten. Diese entwickelten Beschichtungen wurden ebenfalls dafür verwendet, um Kollagen-basierte Wundauflagen mit einem präventiven Schutz vor bakteriellen Kontaminationen bei der Wundversorgung zu versehen. Folglich konnten zwei verschiedene Strategien für die Generierung von Peptid-basierten antimikrobiellen Oberflächenbeschichtungen entwickelt werden. Während sich die kovalente Modifikation von Oberflächen mit antimikrobiellen Peptiden durch einen langanhaltenden Schutz auszeichnet, für welchen jedoch eine direkte Interaktion zwischen den Bakterien und der Oberfläche gewährleistet sein muss, ist die sukzessive Freisetzung eines antimikrobiellen Peptids gut dafür geeignet, um das bakterielle Wachstum bereits in oberflächennahen Regionen inhibieren zu können. Zudem eignet sich die kontinuierliche Abgabe eines antimikrobiell wirkenden Stoffes besonders gut für poröse Oberflächen, bei welchen eine direkte Interaktion mit den Bakterien nicht immer gewährleistet ist. Somit konnte gezeigt werden, dass je nach Anforderung an die Oberfläche verschiedene Modifikationen durchgeführt werden können, um eine auf antimikrobiellen Peptiden basierende Prävention vor bakteriellen Kontaminationen zu gewährleisten.
The intensive use of antibiotics has led to the development of a large variety of drug resistant bacteria, including methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) or ESBL-expressing Enterobacteriaceae. Therefore, the research on new antimicrobial agents for the treatment of bacterial infections has been intensified. However, in recent years only a few new types of antibiotics have been developed. Alternatively, antimicrobial peptides, a promising class of biomolecules, have gained significant ground in research over the last years. They are a diverse class of biomolecules and differ strongly regarding their sequence. Although, in most cases they possess antimicrobial and biocompatible properties, some may also feature cytotoxic properties. This renders them inappropriate for industrial or clinical applications. Furthermore, naturally occurring AMPs may possess limitations due to their manufacturing cost and poor pharmacokinetic properties. Due to these facts it is worthwhile to develop novel antimicrobial peptides with optimized characteristics such as antimicrobial activity, biological compatibility or proteolytic stability. For this purpose, a rational design of artificial peptides with unique primary and secondary structures was conducted. Using different peptide libraries the rational designed peptides were characterized regarding their antimicrobial, cytotoxic and membrane permeabilization properties. Additionally, these features were compared to well-characterized and commonly used AMPs. Based on the results of the different peptide libraries, an optimization of the artificial sequence was carried out and a sequence with extensive antimicrobial as well as biocompatible properties was concluded. This sequence was also characterized by a minimal sequence length and an optimized peptide composition. Additionally, the research revealed a dependency between peptide sequence, computed structural motif and antimicrobial activity. It could be demonstrated that these peptides form putative beta-strand motifs and thereby unique structures, which do not correlate with previously identified alpha-helix or beta-sheet forming peptides. In order to further optimize the artificial peptide a C-terminal amidation was realized. Thus, an electrostatic interaction between the cationic amino acids and the C-terminus was prevented, resulting in an increased stability of the motif. Consequently, an artificial peptide with further increased antimicrobial properties could be developed. Hence, an unnatural modification was introduced into the primary peptide sequence, which prevents proteolytic digestion. Consequently, two optimized artificial antimicrobial peptides could be engineered, which were characterized by improved antimicrobial and biocompatible properties as well as unique secondary structures. These properties render them appropriate for clinical and industrial applications. Furthermore, those results highlight the correlation between this novel beta-strand structure and the antimicrobial properties of bioactive peptides. This structure indicates a high relevance for the in silico design of novel antimicrobial peptides and may be used as lead compound for future drug development. Additionally, the identified antimicrobial acting beta-strand conformation complements the existing alpha-helix and beta-sheet forming peptides, why it may be useful for the still ongoing fundamental research on the mode of action of antimicrobial peptides. Due to the short and simple amino acid sequence of the optimized peptide, it possesses reduced production cost and is therefore applicable for a variety of industrial and clinical uses. Beside the direct therapy of bacteria associated diseases the control of bacterial populations and the protection against bacterial infections are of great interest in today´s society. Because bacteria are able to accumulate on solid material, contaminated surfaces represent a significant reservoir of bacteria. Once bacteria adhere to solid material, they may start to build up colonies resulting in biofilm formation, why preventive methods, which protect against surface-mediated contamination prior to biofilm formation, are beneficial. Thus, two different peptide-based antimicrobial surface coatings were engineered. The covalent surface coatings revealed the antimicrobial mode of action as the decisive parameter for the development of a covalent antimicrobial surface coating since only peptides with pronounced membrane disruption abilities displayed meaningful activity in an immobilized state. In addition, the investigations indicated that various chemical ligations resulted in different activities of the immobilized peptides. Consequently, an optimized covalent peptide-based antimicrobial surface coating was concluded, which was characterized by an improved antimicrobial activity and a reduced peptide amount. The surface coating was also biocompatible, enabling a wide range of applications in an industrial or clinical environment. Alternatively, surface modifications were engineered, which facilitate a continuous release of antimicrobial peptide from the surface. For this purpose the electrostatic deposition of the cationic antimicrobial peptides on negatively charged surface coatings was used. The results revealed the relation between the time dependent release of the peptide and the complexity and electro negativity of the surface coating. Hence, an optimized coating was concluded, which was characterized by long-lasting antimicrobial properties. Additionally, these surface coatings were transferred to collagen-based wound dressings in order to ensure a preventive protection against bacterial infections during wound care. Consequently, two different peptide based antimicrobial surface coating could be engineered. While the covalent coating is characterized by a long-lasting local protection, which requires a direct interaction between the bacteria and the surface, the continuous release of an antimicrobial peptide is well suited to inhibit the bacterial growth already near the surface. Moreover, the latter is particularly suitable for porous surfaces, which may prevent a direct interaction between the bacteria and the antimicrobial coating. Thus, it has been demonstrated that depending on the requirements, various surface modifications could be designed, in order to realize a preventive peptide-based protection against bacterial contamination.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus4-66504
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/4770
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4473
Exam Date: 8-May-2015
Issue Date: 3-Jun-2015
Date Available: 3-Jun-2015
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): Antimikrobielle Peptide
Biokompatibilität
Membranpermeabilität
Oberflächenbeschichtung
Wirkmechanismus
Antimicrobial peptides
Biocompatibility
Membrane permeability
Mode of action
Surface coating
Creative Commons License: https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/de/
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