Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4574
Main Title: Through the mirror
Subtitle: Translation with D-amino acids
Translated Title: Durch den Spiegel
Translated Subtitle: Translation mit D-Aminosäuren
Author(s): Achenbach, John-Philipp
Advisor(s): Lauster, Roland
Nierhaus, Knud H.
Referee(s): Lauster, Roland
Nierhaus, Knud H.
Rappsilber, Juri
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Peptide und Proteine, die in lebenden Zellen durch ribosomale Translation einer messenger RNA hergestellt werden, bestehen ausschließlich aus L-Aminosäuren, obwohl auch D-Aminosäuren in der Natur verbreitet vorkommen. Der prokaryotische Translationsapparat hält etliche Mechanismen bereit, um den Einbau von D-Aminosäuren in Peptide oder Proteine durch ribosomale Synthese zu verhindern, da der zufällige Fehleinbau von D-Aminosäuren die Faltung eines Proteins in seine aktivie Konformation behindern kann. Die Anhäufung derartiger Fehleinbauten hätte letale Konsequenzen für eine Zelle. Die Chiralität der Proteinbausteine wird an vier aufeinanderfolgenden Kontrollstellen überwacht: 1. Aminoacyl-tRNA Synthetasen verestern Aminosäuren mit tRNA Molekülen, wobei Aminoacyl-tRNA entsteht. Die meisten dieser Enzyme sind stereoselektiv und beladen tRNA nicht mit D-Aminosäuren. 2. D-Tyrosyl-tRNA Deacylase kontrolliert die gebildete Aminoacyl-tRNA und deacyliert selektiv D-Aminosäuren. 3. Elongationsfaktor Tu ist ein Translationsfaktor, der Aminoacyl-tRNA bindet und zum Ribosom transportiert, aber D-Aminoacyl-tRNA dabei stark benachteiligt. 4. Das Ribosom verwendet Aminoacyl-tRNA als Substrat, um Peptidketten gemäß der Sequenz der codierenden messenger RNA zu bilden. Das Ribosom ist ebenfalls stereoselektiv und kann D-Aminoacyl-tRNA aussortieren. Diese Arbeit beschäftigt sich damit, wie die Stereoselektivität des Translationsapparats von E. coli in einem definierten, zellfreien in vitro Translationssystem bestehend aus individuell aufgereinigten Translationsfaktoren und Ribosomen oder Mutanten derselben umgangen werden kann. Das Ziel war dabei, effizienten, gerichteten Einbau von D-Aminosäuren zu erreichen, was sich sowohl für einige Anwendungen wie z.B. der Identifikation neuer Wirkstoffe mit Hilfe von auf in vitro Translation basierenden Techniken als sinnvoll erweisen kann, wie auch generell das Verständnis dafür verbessert, wie Stereoselektivität auf molekularer Ebene funktioniert. Das Ziel wurde durch die folgenden Maßnahmen erreicht: 1. D-Aminosäuren wurden mit Hilfe von Ribozymen (Flexizymes) an tRNA gekoppelt. 2. Das Translationssystem besteht nur aus einzeln aufgereinigten Komponenten und enthält keine D-Tyrosyl-tRNA Deacylase. 3. Um den Transport von D-Aminoacyl-tRNA zum Ribosom durch EF-Tu zu gewährleisten, wurde eine tRNA gewählt, die eine besonders hohe, intrinsische Affiniät zu EF-Tu aufweist. 4. Das Gleichgewicht zwischen Aussortierung von D-Aminoacyl-tRNA und Einbau von D-Aminosäuren durch das Ribosom wurde durch Verwendung einer tRNA, die eine besonders hohe intrinsische Affinität zur ribosomalen A-Stelle hat, in Richtung des Einbaus verschoben Zusammenfassend konnte der effiziente Einbau 17 verschiedener D-Aminosäuren von 18 getesteten gezeigt werden, und in einigen Fällen sogar der Einbau aufeinanderfolgender D-Aminosäuren.
In a living cell, peptides or proteins produced by ribosomal translation of a messenger RNA consist exclusively of L-amino acids (L-aa), although D-amino acids (D-aa) are prevalent in nature. The bacterial translation apparatus holds several mechanisms to counteract the incorporation of D-aa into peptides or proteins by ribosomal synthesis, because the accidental incorporation of D-aa may hamper the folding of a nascent protein into its active conformation. Accumulation of such misincorporations would have lethal consequences for a cell. The chirality of the protein building blocks is controlled at four sequent checkpoints: 1. Aminoacyl-tRNA synthetases (aaRS) esterify amino acids to tRNA molecules, giving rise to aminoacyl-tRNA. Most of the enzymes are stereoselective and do not charge D-amino acids. 2. D-tyrosyl-tRNA deacylase controls the formed aminoacyl-tRNAs and selectively deacylates D-amino acids. 3. Elongation factor Tu (EF-Tu) is a translation factor that binds to aminoacyl-tRNA and shuttles it to the ribosome, but strongly discriminates against D-aminoacyl-tRNA. 4. The ribosome uses aminoacyl-tRNA as a substrate to build up peptide chains in an mRNA sequence dependent manner. The ribosome is also stereoselective and can reject D-aminoacyl-tRNA. This work focuses on the bypassing of stereoselectivity of the E. coli translation apparatus to achieve efficient site-directed incorporation of D-amino acids, which can be useful both for a number of applications such as drug discovery by in vitro translation based techniques as well as to deepen the understanding how stereoselectivity is established on a molecular level. This goal has been achieved by the following means: 1. D-amino acids are attached to tRNA molecules using ribozymes (Flexizymes) instead of aminoacyl-tRNA synthetases. 2. A defined cell-free in vitro translation system made of individually purified translation factors and ribosomes or mutants thereof was prepared that does not contain D-tyrosyl-tRNA deacylase. 3. To enable EF-Tu mediated delivery of D-aa-tRNA to the ribosome, the D-aa were attached to a tRNA that shows a high intrinsic affinity for EF-Tu. 4. The equilibrium between D-aa-tRNA rejection and D-aa incorporation by the ribosome was shifted towards incorporation by using a tRNA that also shows a high intrinsic affinity to the ribosomal A-site. The efficient incorporation of 17 different D-aa out of 18 D-aa tested could be demonstrated and in some cases also the incorporation of consecutive D-aa.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus4-69134
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/4871
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4574
Exam Date: 15-Jul-2015
Issue Date: 12-Aug-2015
Date Available: 12-Aug-2015
DDC Class: 572 Biochemie
Subject(s): Chemische Biologie
D-Aminosäuren
In vitro Translation
Stereoselektivität
Zellfreie Proteinsynthese
Cell-free protein synthesis
Chemical biology
D-amino acids
In vitro translation
Stereoselectivity
Creative Commons License: https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/de/
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