Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4587
Main Title: Charakterisierung der enzymatischen Umsetzung von cis-[3,4-2H2]-3,4-Epoxydecansäuremethylester in Saccharomyces Stämmen
Translated Title: Characterization of enzymatic conversion of cis-[3,4-2H2]-3,4-epoxydecanoate in Saccharomyces strains
Author(s): Thörner, Sarah
Advisor(s): Garbe, Leif-Alexander
Referee(s): Garbe, Leif-Alexander
Lange, Harald
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Der Abbaumechanismus von epoxidierten Fettsäuren ist wissenschaftlich von besonderem Interesse, da sie wichtige Aufgaben erfüllen (z. B. Regulation Pathogenabwehr) aber auch aufgrund ihrer gespannten Ringstruktur toxisch, kanzerogen und mutagen wirken können. Die enzymatische Umsetzung wird vor allem durch Epoxidhydrolasen (EH) katalysiert. Dabei werden unter Inversion der Konfiguration (trans-Hydrolyse) aus cis-Epoxiden threo-Diole und aus trans-Epoxiden erythro-Diole, die weiter zu Hydroxylactonen reagieren können. Die einzig für Saccharomyces cerevisiae bekannte EH ist die Leukotrien A4 Hydrolase. Sie hydrolisiert substratspezifisch [5S,6S]-Leukotrien A4 (LTA4) zu [5S,6S]-DEHETE unter Retention der Konfiguration. Um weitere EH in Saccharomyces Stämmen charakterisieren zu können, die unter Retention der Konfiguration arbeiten, wurde (±)-cis-[3,4-2H2]-3,4-Epoxydecansäuremethylester als Substrat synthetisiert. Für die Hydrolyse gibt es zwei Möglichkeiten: Einerseits unter Inversion der Konfiguration (chemisch) – Produkte: threo-[3,4-2H2]-3,4-Dihydroxydecansäuremethylester bzw. threo-[3,4-2H2]-3-Hydroxy-γ-decalacton und anderseits unter Retention der Konfiguration (enzymatisch durch ein bisher unbekanntes Enzym EH-1) – Produkte: erythro-[3,4-2H2]-3,4-Dihydroxydecansäuremethylester bzw. erythro-[3,4-2H2]-3-Hydroxy-γ-decalacton. Um die enzymatische Umwandlung des Substrats durch EH-1 zu charakterisieren, wurde ein Enzymparametertest im Miniinkubationsansatz entwickelt. Zur Analyse der Abbauprodukte wurde ein Verfahren mittels GC-EI-MS (SIM-Modus) etabliert. Die Enantiomere wurden dabei nicht gaschromatographisch getrennt. Als Messgröße für die enzymatische Umwandlung wurde der E/t-Quotient aus der Summe der Konzentrationen der erythro-Abbauprodukte zu der Summe der Konzentrationen der threo-Abbauprodukte festgelegt. Mit Hilfe des Enzymparametertests konnte die Existenz von EH-1 in einer Leukotrien A4 Hydrolase deletierten Knockout-Mutante S. cerevisiae BY4741 ΔYNL045W (Mutante) nachgewiesen werden. Dabei wurden folgende Parameter für EH-1 optimiert: pH-Optimum in Phosphat- und Tris/EDTA-Puffer (zwei lokale Maxima pH-Bereich > 8,0), Zellkonzentration (80 mL Zellbrühe auf 10 mL Puffer), Substratkonzentration (0,27 mg/mL), Pufferkonzentration (10 mM), Temperatur (24 ± 1 °C) sowie Dauer der Inkubation (20 bis 24 h). Für S. cerevisiae BY4741 Wildtyp (Wildtyp) sowie für S. carlsbergensis RH (RH Stamm) wurden vergleichbare Ergebnisse erzielt, dabei lagen für den Stamm mit der höchsten Zelldichte auch die E/t-Quotienten am höchsten. Für S. bayanus lag die Zelldichte immer am höchsten, die E/t-Quotienten waren aber niedriger als für die anderen Stämme. Die Lokalisierung von EH-1 in der Mutante erfolgte mittels Zellaufschluss. Dabei wurden sowohl im Pellet als auch im Überstand enzymatisch gebildete erythro-Abbauprodukte gefunden. In Phosphatpuffer lagen die E/t-Quotienten im Pellet höher und in Tris/EDTA-Puffer im Überstand. Somit konnte die Lokalisierung von EH-1 nicht eindeutig geklärt werden. Auch nicht mit Hilfe der anderen drei Stämme, da diese vergleichbare Ergebnisse lieferten. Mittels Isoelektrischer Fokussierung (IEF) wurde der Isoelektrische Punkt von EH-1 über die Fraktionen mit dem höchsten E/t-Quotienten auf den pH-Bereich 5,15 bis 5,75 eingegrenzt. Die Ergebnisse für Wildtyp und RH Stamm waren vergleichbar. Für S. bayanus ergaben sich zwei lokale Maxima. Das Molekulargewicht von EH-1 konnte in der Mutante mittels SDS-PAGE auf < 78 kDa eingegrenzt werden, mit einem Hinweis auf ca. 30 kDa. Wildtyp und RH Stamm lieferten vergleichbare SDS-Gele. Für S. bayanus ergab sich ein komplett anderes Bild bei den SDS-Gelen. Dies lag möglicherweise an dem unterschiedlichen Genotyp im Vergleich zu den S. cerevisiae Stämmen. Bei S. carlsbergensis RH handelt es sich um einen Hybrid aus S. bayanus und S. cerevisiae. Der RH Stamm lieferte vergleichbare Ergebnisse zu den S. cerevisiae Stämmen. Deshalb ist davon auszugehen, dass in Bezug auf den Abbau epoxidierter Fettsäuren, die genetische Ausprägung der S. cerevisiae dominiert. Da die Ergebnisse zur Lokalisierung von EH-1 nicht eindeutig waren, handelt es sich bei EH-1 möglicherweise nicht um ein Enzym, sondern um verschiedene Enzyme. Weitere Hinweise darauf sind zwei lokale Maxima für das pH-Optimum in Phosphat- und Tris/EDTA-Puffer sowie ein vergleichsweise breiter pH-Bereich für den Isoelektrischen Punkt.
The hydrolysis of epoxy fatty acids (EFAs) is an important concern of life sciences and related fields of research. EFAs have multiple roles in nature, their reactive epoxide function is responsible for their toxic, carcinogenic, and mutagenic properties. The hydrolysis of EFAs is primarily catalyzed by enzymes called epoxide hydrolases (EH). EH hydrolyze cis-epoxides into threo-diols and trans-epoxides into erythro-diols. Those diols can further react into hydroxy lactones. The epoxide hydrolysis occurs under retention of the configuration, also called trans-hydrolysis. In Saccharomyces cerevisiae only one EH has been characterized so far. However, this EH, namely the Leukotrien A4 hydrolase, hydrolyses [5S,6S]-Leukotrien A4 (LTA4) into [5S,6S]-DEHETE under retention of its configuration. Previous work indicate the occurrence of an additional EH enzyme in yeast, thus the aim of the present work was to prove its presence and to characterize this enzyme, (here called EH-1). For this purpose a stable isotope labeled substrate ((±)-cis-[3,4-2H2]-3,4-epoxydecanoate) was chemically synthesized and used in comparative incubation experiments including four different yeast strains. Generally, two routes of substrate conversion can occur: Firstly, hydrolysis under inversion of configuration yielding threo-[3,4-2H2]-3,4-dihydroxydecanoate and threo-[3,4-2H2]-3-hydroxy-γ-decalactone. Secondly, hydrolysis under retention of configuration yielding erythro-[3,4-2H2]-3,4-dihydroxydecanoate and erythro-[3,4-2H2]-3-hydroxy-γ-decalactone. The first reaction proceeds chemically, whereas the second reaction is catalyzed by a so far unknown enzyme EH-1. In order to monitor the activity of EH-1 an enzyme parameter assay (micro incubation) as well as a GC-SIM-MS method for quantification the 2H-labeled diastereomers of diols and hydroxy lactones was established, without separating the enantiomers. Enzyme catalysis (activity) was judged by introduction of the so called E/t-quotient, which compares the ratio of chemical threo- and enzymatic erythro-degradation products. By means of incubation experiments using S. cerevisiae BY4741 ΔYNL045W (mutant), in which genes for Leukotrien A4 Hydrolase are deleted, the presence of EH-1 was evidenced. Highest enzyme activity was detected in incubations (20-24 hours) in 10 mM phosphate or Tris/EDTA buffers with pH > 8 (two local optima), a substrate concentration of 0,27 mg/mL at 24 ± 1 °C. Incubation experiments revealed similar EH activities for the mutant strain, S. cerevisiae BY4741 Wildtyp (wild type), as well as for S. carlsbergensis RH (RH strain). Enzyme activity and cell density correlated, with exception for S. bayanus, which showed the highest cell density but the lowest E/t-quotient throughout the incubation experiments. In order to characterize EH-1, its localization within the yeast cell, its molecular weight (MW), and isoelectric point (IEP) were determined. Enzyme localization was carried out by cell disruption (ball mill). In phosphate buffer higher EH-1 activities were found in the pellets (bound enzyme), in Tris/EDTA buffer higher EH-1 activities were found in the supernatant (soluble enzyme). Thus, the enzyme localization in the mutant strain could not be clarified, whereas similar results were obtained for wild type, RH strain, and S. bayanus. Isoelectric focusing resulted in an IEP in the range of pH 5,15 - 5,75, for mutant, wild type, and RH strain, whereas S. bayanus showed two local maxima in that range. SDS-PAGE provided the following information: The MW of EH-1 is <78 kDa, with strong evidence being in the range of 30 kDa. Comparison of SDS-PAGE for mutant, wild type, and RH strain showed similar results, whereas again the results for S. bayanus differed. RH is a hybrid of S. bayanus and S. cerevisiae, in respect to the hydrolysis of EFAs obviously the genes of S. cerevisiae dominate. Based on the fact, that localization of EH-1 was not unambiguous, two local pH optima and a rather broad range for IEP were found, EH activity in yeast might not be related to a single enzyme aside Leukotrien A4 hydrolase.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus4-69593
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/4884
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4587
Exam Date: 9-Jul-2015
Issue Date: 31-Jul-2015
Date Available: 31-Jul-2015
DDC Class: 572 Biochemie
Subject(s): Epoxidhydrolasen
Retention der Konfiguration
Enzymparametertest
Epoxid
Hefe
Epoxide hydrolases
retention of the configuration
enzyme parameter assay
epoxide, yeast
Creative Commons License: https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/de/
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