Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4701
Main Title: Real-time-PCR-Nachweissystem für Hefen und Schimmelpilze in Getränken
Translated Title: Real time PCR detection system for yeasts and molds in beverages
Author(s): Schulz, Silvana
Advisor(s): Berghof-Jäger, Kornelia
Referee(s): Stahl, Ulf
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: In der vorliegenden Arbeit wurde ein Real-Time-PCR-Assay entwickelt, das den universellen Nachweis von Pilzen ermöglicht. Mit der Vorauswahl an Primer- und Sondenkandidaten, welche einen hoch konservierten DNA-Abschnitt der 28S-rDNA flankieren, wurden in-silico-Analysen durchgeführt, die zeigen konnten, dass das Phylum der Mucoromycotina nicht 100% erfasst wurde. Nach Zusatz eines weiteren Primers konnten über 250 verschiedene Pilzspezies der relevanten Phyla mit dem Real-Time-PCR-Assay nachgewiesen werden. Die Detektionsgrenze des Assays liegt im Bereich von 1,6 Genomäquivalenten. Die Quantifizierung fungoider DNA wurde mit 15 lebensmittelrelevanten Spezies vorgenommen. Es konnte gezeigt werden, dass die Quantifizierung der Pilze trotz verschiedener Gen-Kopienzahlen und Genomgrößen reproduzierbar möglich ist. Durch das Mitführen einer Plasmidpositivkontrolle, die im Rahmen dieser Arbeit konstruiert wurde, kann der Kontaminationsgrad einer Probe bestimmt werden. Exklusivitätsprüfungen mit DNA aus Zelllinien sowie bakterieller und pflanzlicher DNA haben die Spezifität des Verfahrens bestätigt. Der Assay beinhaltet Mechanismen zur Vermeidung von Kreuzkontaminationen wie z.B. die Verwendung von Uracil-DNA-Glykosylase. Das Probenaufarbeitungssystem ist für die Anwendung in der Getränkeindustrie vorgesehen. Alkoholfreie Getränke und ihre Einsatzstoffe können auf den Befall mit Verderbsorganismen hin geprüft werden. Es werden zwei Extraktionsverfahren vorgestellt: filtrierbare Flüssigkeiten werden filtriert und der Filter anschließend weiter aufgearbeitet; nicht-filtrierbare Flüssigkeiten können nach einer möglichen Voranreicherung direkt ins Reaktionsgefäß überführt werden. Die Nachweisgrenze liegt bei 1,5x101 KBE (in 100 ml) für filtrierbare Flüssigkeiten und 5x101 KBE (in 100 µl) für nicht-filtrierbare Flüssigkeiten. Um nur die Kontamination lebensfähiger Pilze anzuzeigen, beinhaltet die Probenaufarbeitung ein Verfahren zur Lebend/Tot-Differenzierung mithilfe eines interkalierenden Farbstoffs. Die Anwendbarkeit der Aufarbeitung wird mit Brauereieinsatzstoffen sowie Realproben untersucht.
This graduate thesis describes the development of a real-time PCR assay for the universal detection of fungi. The preselected primer and probes candidates flank the highly conserved 28S rDNA region but insilico analyses showed that they did not fit optimal for the phylum Mucoromycotina. With an additional primer, it was possible to detect more than 250 fungi species. The limit of detection for this assay is 1.6 genome equivalents. The quantification of fungal DNA was evaluated using 15 food-relevant microorganisms. Although, fungi differ in the gene copy numbers and the genome size it was shown that the quantification of the DNA is reproducible using the artificial positive control. The exclusivity of the assay was proofed with DNA extracted from bacteria, plants and cell cultures. The real-time PCR assay contains several reagents to avoid cross contaminations, for example the enzyme uracil-DNA-glycosylase. The sample preparation system was made for the beverage industry. Soft drinks and their raw material can be checked for fungal contaminations using the following two extraction methods: filterable fluids are filtered and the whole filter passes the sample preparation while non-filterable fluids are transferred to the reaction tube directly after an optional pre-enrichment. The limit of the detection of the sample preparation system is 1.5x101 cfu (per 100 ml) for filterable and 5x101 cfu (per 100 µl) for non-filterable fluids. With the addition of an intercalating dye, only the DNA of living fungi can be detected in the real-time PCR. The applicability of the preparation system was tested with brewery raw material and real samples.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus4-71675
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/4998
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4701
Exam Date: 9-Jun-2015
Issue Date: 13-Nov-2015
Date Available: 13-Nov-2015
DDC Class: 579 Mikroorganismen, Pilze, Algen
Subject(s): Hefe
Schimmelpilz
Quantifizierung
Lebensmittel
Verderb
Yeast
mold
quantification
food
spoilage
Creative Commons License: https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/de/
Appears in Collections:Technische Universität Berlin » Fakultäten & Zentralinstitute » Fakultät 3 Prozesswissenschaften » Institut für Biotechnologie » Publications

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