Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4765
Main Title: Vibrational spectroscopy of the active site and iron sulfur clusters of the membrane bound hydrogenase from Ralstonia eutropha
Translated Title: Schwingungsspektroskopie am aktiven Zentrum und den Eisen-Schwefel-Clustern der membrangebundenen Hydrogenase von Ralstonia Eutropha
Author(s): Siebert, Elisabeth
Advisor(s): Hildebrandt, Peter
Zebger, Ingo
Referee(s): Hildebrandt, Peter
Dobbek, Holger
Zebger, Ingo
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Die Suche nach einer umweltfreundlichen und effizienten Energiequelle hat die Hydrogenasen in den Mittelpunkt der Enzymforschung gebracht. Diese Enzyme könnten eine zentrale Komponente in zukünftigen Bio-Brennstoffzellen werden, da sie die reversible Oxidation von molekularem Wasserstoff in Protonen und Elektronen katalysieren. In dieser Arbeit wurde die Sauerstoff-tolerante, membrangebundene [NiFe] Hydrogenase (MBH) von Ralstonia eutropha mittels Infrarot (IR) und Resonanz Raman (RR) Spektroskopie untersucht. Dieses Enzym ist für die technologische Anwendung von besonderem Interesse, da es seine katalytische Aktivität auch unter atmosphärischen Sauerstoffkonzentrationen beibehält. Mit der IR Spektroskopie wurden die Redox-Übergänge des aktiven [NiFe] Zentrums als Funktion von externen Potentialen untersucht. Damit war es möglich die Umwandlung der verschiedenen Redox-Zustände des aktiven Zentrums innerhalb des katalytischen Zyklus sichtbar zu machen. Diese Untersuchungen zeigten, dass der Reoxidationsprozess nur dann vollständig reversibel ist, solange die MBH mit ihrem natürlichen Elektronen-Akzeptor Cytochrom b in den Fragmenten der Zellmembran verbunden ist. Der gesamte Reoxidationsprozess wurde erfolgreich mit gekoppelten monoexponentiellen Gleichungen modelliert, was bestätigt, dass die zugrunde liegenden Prozesse Ein-Elektronen Übergänge sind. Der gelösten MBH, ohne natürlichen Elektronen-Akzeptor, ist es nicht möglich komplett reversibel mit Wasserstoff und Sauerstoff zu reagieren, da es teilweise zur Bildung einer irreversibel inaktiven Spezies während des Reoxidationsprozesses kommt. Vergleichende Untersuchungen unter anaeroben Bedingungen an solchen MBH Proben ergaben jedoch, dass ein überwiegender Teil dieser Spezies aktiviert werden kann, wenn ein hinreichend hohes Überpotential angelegt wird und Redox-Mediatoren zugegen sind. Weiterhin wurden die IR-Komponentenspektren, mit den entsprechenden CO und CN Streckschwingungen aller aktiven und inaktiven Redox-Zustände des aktiven [NiFe] Zentrums bestimmt. Mit der vorliegenden Arbeit wurde die RR Spektroskopie, neben der IR und EPR (Electron Paramagnetic Resonance) Spektroskopie, als weitere leistungsfähige Methode etabliert um die verschiedenen Kofaktoren der MBH, das heißt die FeS Cluster und das aktive [NiFe] Zentrum, zu erforschen. Eine konsistente Zuordnung der entsprechenden Schwingungsmoden im Bereich von 300 bis 700cm-1 wurde durch wellenlängen- und winkelabhängige RR Studien, statistische Analysen der experimentellen RR Spektren, Isotopenmarkierung sowie durch quantenchemische Berechnungen (Y. Rippers) erreicht. Die detektierten Schwingungsmoden des aktiven Zentrums wurden als Fe-CO/CN Moden des Nia-S und Nia-L Redox-Zustands identifiziert. Diese beiden aktiven Zustände werden durch einen lichtinduzierten Prozess im RR Experiment geformt. Mit dieser lichtinduzierten Reaktivierung des aktiven Zentrums könnte der Potentialbereich für die H2-Oxidation in einer zukünftigen Bio-Brennstoffzelle erweitert werden, was wiederum die Leistungsfähigkeit der Brennstoffzelle erhöhen würde. Die intensivsten Schwingungsmoden aller drei FeS Cluster wurden mittels winkelabhängiger RR Spektroskopie sowie RR Spektren von MBH Varianten mit modifizierten FeS Clustern unterschieden. Somit konnte auch das Schwingungsspektrum des superoxidierten proximalen FeS Clusters extrahiert werden. Dieser [4Fe3S] Cluster ist einzigartig in den Sauerstoff-toleranten membrangebundenen Hydrogenasen und ihm wird eine zentrale Rolle für den Schutz des aktiven Zentrums vor oxidativer Schädigung zugeschrieben. Die RR Spektroskopie zeigte, dass in der natürlichen Konfiguration des superoxidierten Clusters ein Hydroxylligand an ein Fe Ion koordiniert ist und dieser Ligand während des Reoxidationsprozesses zu einem hohen Anteil erneut gebunden wird. Die RR Spektren von isotopenmarkierten MBH Proben zeigten weiterhin, dass der Hydroxylligand bevorzugt aus molekularem Sauerstoff, der in einem Vier-Elektronen Drei-Protonen Prozess reduziert wurde, geformt wird. Wassermoleküle der Lösung in der Nähe des proximalen Clusters stellen eine alternative Quelle für diesen Liganden dar, aber der entsprechende Prozess ist wesentlich langsamer. Diese mechanistischen und strukturellen Einblicke gehen über die unmittelbar aus der Kristallstruktur zugänglichen Informationen hinaus. Das erweiterte Verständnis der experimentellen RR Spektren der MBH von Ralstonia eutropha stellt die Basis für zukünftige Untersuchungen des MBH Wildtyps und seiner Varianten, mit Modifikationen an den FeS Clustern sowie des aktiven [NiFe] Zentrums,dar.
The need for an environmentally friendly, highly efficient energy source has brought hydrogenases into the center of attention in enzyme research. Hydrogenases catalyze the reversible cleavage of molecular hydrogen into two protons and two electrons and could therefore become a key component of future biological fuel cells. In this thesis, the oxygen-tolerant, membrane bound [Nife] hydrogenase (MBH) from Ralstonia eutropha is investigated by means of Infrared (IR) and Resonance Raman (RR) spectroscopy. This enzyme is of particular technological interest, because it preserves catalytic activity even under ambient oxygen concentrations. With IR spectroscopy, redox transitions of the [NiFe] active site were studied as a function of externally adjusted potentials. Thus, it was possible to make the interconversion of the active site redox states within the catalytic cycle visible. The results demonstrate that the reoxidation process is only reversible if the MBH is still attached to its natural electron acceptor cytochrome b in membrane fragments, as it is in its natural environment. The entire reoxidation process was successfully modeled with a set of coupled mono-exponential functions, confirming that the underlying processes are one-electron transitions. The solubilized MBH is not capable of reacting in a fully reversible fashion with hydrogen and oxygen, since the formation of the irreversible inactive species is also possible during the reoxidation process once the natural electron acceptor is lost. Comparative studies revealed that major fractions of such MBH samples can be reactivated in the presence of redox mediators and sufficiently high overpotentials. Additionally, IR component spectra involving the CO and CN stretching modes were determined for all catalytically active and inactive redox species of the [NiFe] active site. With the present work RR spectroscopy is established as a powerful method complementary to IR and EPR (Electron Paramagnetic Resonance) spectroscopy to investigate the various cofactors of the MBH, i.e. the [NiFe] active site and the FeS clusters. A consistent assignment of the respective vibrational modes in the region from 300 to 700cm-1 was achieved by wavelength- and angle-dependent RR studies, statistical analyses on experimental RR spectra as well as isotopic labeling and quantum chemical calculations by Y. Rippers. The detected vibrational modes of the active site were assigned to Fe-CO/CN modes of the redox states Nia-S and Nia-L. These two active species are formed via light-induced processes in the RR experiment. Due to this photo-induced reactivation of the active site the 'potential window of activity' for H2-oxidation in a fuel cell might be broadened and thus the performance of the biofuel cell increased. The most intense FeS stretching modes of all three FeS clusters were discriminated with angle-dependent RR spectroscopy and RR spectra from samples of MBH variants with genetically engineered FeS clusters. This also yields the first vibrational spectroscopic description of the superoxidized proximal cluster. This proximal [4Fe3S] cluster is unique in oxygen-tolerant membrane bound hydrogenases and is thought to play a key role for protecting the active site from oxidative damage. RR spectroscopy revealed that the native configuration of the superoxidized cluster has a bound hydroxyl group at one Fe ion. This hydroxyl group is rebound in high amounts within the reoxidation process of the MBH. RR spectra of isotopically labeled MBH samples demonstrated that the hydroxyl ligand at the superoxidized proximal cluster is preferentially formed from molecular oxygen, which is reduced in a four-electron three-proton process. Solvent water molecules in the vicinity of the proximal cluster are an alternative source for the ligand, but this binding process is much slower. These mechanistic and structural insights even exceed the information derived from crystallographic data. The advanced understanding of the experimental RR spectra of the MBH from Ralstonia eutropha will be the basis for future investigations of the wildtype enzyme and specific genetically engineered MBH variants with modifications at the [NiFe] active site or the FeS clusters. Further aspects of the catalytic cycle may be elucidated with systematically varied experimental conditions as well.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus4-73022
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/5062
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-4765
Exam Date: 4-Sep-2015
Issue Date: 19-Oct-2015
Date Available: 19-Oct-2015
DDC Class: 541 Physikalische Chemie
Subject(s): Einzelne Kristalle
Hydrogenase
Infrarot
Resonanz Raman
Schwingungsspektroskopie
Winkelabhängigkeit
Angle dependence
Hydrogenase
Infrared
Resonance Raman
Single crystals
Vibrational spectroscopy
Creative Commons License: https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/de/
Appears in Collections:Technische Universität Berlin » Fakultäten & Zentralinstitute » Fakultät 2 Mathematik und Naturwissenschaften » Institut für Chemie » Publications

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
siebert_elisabeth_online.pdfOnline-Version6.59 MBAdobe PDFThumbnail
View/Open
siebert_elisabeth_druck.pdfDruck-Version6.36 MBAdobe PDFThumbnail
View/Open


Items in DepositOnce are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.