Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-5046
Main Title: Development of novel mass spectrometry guided techniques for the discovery, structural elucidation and biological assessment of different peptide toxins
Translated Title: Entwicklung neuer massenspektrometrischer Methoden für die Suche, Strukturaufklärung und biologische Untersuchung von peptidischen Toxinen
Author(s): Petras, Daniel
Advisor(s): Süßmuth, Roderich
Referee(s): Calvete, Juan
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: en
Has Part: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-5867
Abstract: Natürliche Toxine sind von großer Bedeutung für den Menschen. Ihre biochemischen Eigenschaften resultieren in einem „Ying und Yang“ an tödlichem und zugleich lebensrettenden Potenzial für uns. Etliche pharmazeutische Wirkstoffe basieren auf natürlichen Giften, insbesondere auf peptidischen Toxinen, welche jedes Jahr hunderttausende Menschenleben retten. Im gleichen Moment sind einige dieser Toxine verantwortlich für hunderttausende Todesfälle und fatale gesundheitliche Einschränkungen. Durch die konstante Verbesserung bio-analytischer und speziell massenspektrometrischer Methoden sind wir auf dem Weg zu einem „kompletten Bild“ an Informationen bezüglich Identität, Konzentration und Konformation bzw. räumliche Interaktionstelle von Naturstoffen oder Toxinen in verschiedenen biologischen Systemen. Diese neuen technologischen Möglichkeiten werden uns zwangsläufig zu einem umfassenden Verständnis von Toxinen und anderen Naturstoffen und ihrer Interaktion mit anderen biologisch relevanten Molekülen führen. Hierdurch werden wir das enorme Reservoir an solchen Verbindungen besser aufdecken und ihr Potential als Modellverbindungen, diagnostische Werkzeuge und schlussendlich als neue therapeutische Wirkstoffe nutzen. In dieser Arbeit sind die Ergebnisse bezüglich der Suche, Strukturaufklärung, der biochemischen und pharmazeutischen Untersuchung zweier verschiedener Toxin-Klassen, unter Zuhilfenahme neuer massenspektrometrischer Analysemethoden, gezeigt und diskutiert. Das erste Beispiel handelt von dem nicht-ribosomal synthetisierten Peptid-Polyketid-Hybrid Albicidin, welches von dem Zuckerrohr-Pathogen Xanthomonas albilineans synthetisiert wird. Durch die Sequenzierung des Genoms von Xanthomonas albilineans war es uns möglich die einzigartige biologische Nische und den besonderen Genotyp, innerhalb der Xanthomonaden, welcher etliche ungewöhnliche Biosynthese Gencluster enthält, zu beschreiben. Einer dieser Gencluster ist für die Biosynthese des Phytotoxins Albicidin, einem starken DNA-Gyrase Inhibitor, welcher auch hochwirksam gegen Gram-positive und Gram-negative Bakterien ist, verantwortlich. Die Strukturaufklärung von Albicidin deckte ein bisher unbekanntes chemisches Gerüst auf, welche bis auf Cyano-Alanin und Zimtsäure ausschließlich aus para-Aminobenzoesäure-Derivaten besteht. Die heterologe Produktion und darauf aufbauende in vitro Experimente verschiedener Module der Nicht-Ribosomalen-Peptidsynthetase gab uns eine detaillierte Einsicht in die Biosynthesemaschinerie, was uns half ein umfassendes Biosynthesemodell für Albicidin aufzustellen. Durch non-targeted Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) konnten wir mehrere Albicidin Derivate, wie z.B. N-terminal carbamoyliertes Albicidin identifizieren. Die Struktur von Carbamoyl-Albicidin konnte durch hochauflösende MS/MS aufgeklärt und die Biosynthese ebenfalls durch heterologe Produktion der Carbamoyltransferase und in vitro Assays sowie einer Geninaktivierungsmutante verifiziert werden. Die Totalsynthese von Albicidin sowie Carbamoyl-Albicidin ermöglichte uns schließlich die detaillierte Testierung der biologischen Aktivitäten durch in vitro Gyrase-inhibierung und Testierung der antibakteriellen Eigenschaften. Carbamoyl-Albicidin zeigte hierbei stärkere inhibitorische Effekte gegenüber Gyrase als Albicidin, was dafür spricht, dass die Carbamoylierung ein Teil der biosynthetischen Reifung von Albicidin ist. Der zweite Teil dieser Arbeit handelt von der Einführung und ersten Anwendung von Top-down Massenspektrometrie für die Analyse von Schlangengiften. In einer Machbarkeitsstudie haben wir Gift der Königskobra, Ophiophagus hannah, mit Hilfe einer Top-down Methode analysiert und etliche Toxine verschiedener Proteinfamilien nachgewiesen. Unter diesen Toxinen waren hauptsächlich Drei-Finger-Toxine, ein Kunitz-artiger Proteaseinhibitor, Ohanin, eine bisher unbekannte A2-Phospholipase sowie ein Cystein-reiches-Sekretionsprotein (Ophanin). Eine komplementäre bottom-up Analyse führte zu einem kompletten, Lokus-aufgelösten Venom-Repertoire der Königskobra - der größten bekannten Giftschlange. Als erstes Beispiel für eine Otter-Spezies haben wir das Venom der Anatolischen Wiesenotter, Vipera anatolica, durch eine Kombination aus Top-down und Bottom-up Venomics analysiert. Durch diese Analyse konnten wir etliche Metalloproteasen, Cystein-reiche-Sekretionsproteine, einen Metalloproteaseinhibitor, A2-Phospholipasen, Disintegrine, eine Serinprotease, Typ-C Lektine sowie einen Kunitz-artigen Proteaseinhibitor identifizieren. Des Weiteren konnten wir etliche Isoformen der oben beschriebenen sowie unbekannten Toxine detektieren, was für eine große, bisher nicht beschriebene Komplexität von Schlangengiften spricht, die mit herkömmlichen bottom-up Techniken unentdeckt geblieben wäre. Schlussendlich konnten wir hierdurch eine bioaktive Komponente des Venoms als ein heterodimeres Disintegrin identifizieren, welches vielversprechende Aktivität gegen Krebszellen zeigte.
Natural toxins play an important role for human health. Their biochemical properties result in a “ying and yang” of deadly and lifesaving potential. Several drugs are based on natural and especially peptidic toxins, saving hundred thousands of human lives every year. At the same time, some of these toxins are responsible for hundreds of thousands of deaths and permanent health issues. With the constant improvement of bioanalytical and especially mass spectrometric techniques, progress has been made towards the accomplishment of “complete pictures” of identities, concentration and spatial location of biomolecules, and in particular toxins, in different biological systems. These technological improvements will enable us to gain a more complete understanding of toxins and all other natural products and their biological interactions. Furthermore these improvements will enable us to better uncover and utilize their enormous potential as biomedical models, diagnostic tools and ultimately novel therapeutics. In this work, the discovery, structural elucidation, biochemical investigation and finally assessment as potential drugs of two classes of natural toxins are shown and discussed. The first part is dedicated to the non-ribosomally synthesized peptide-polyketide-hybrid albicidin, which is produced by a sugar cane pathogenic bacterium, Xanthomonas albilineans. By means of the sequencing of the genome of Xanthomonas albilineans we were able to describe its unique biological niche and special genotype among other xanthomonads, containing a number of unusual biosynthetic gene clusters. One of these gene clusters is responsible for the biosynthesis of the phytotoxin albicidin, a potent DNA gyrase inhibitor, which is also highly active against Gram positive and Gram negative bacteria. The structure elucidation revealed the hitherto unknown structure of albicidin, revealing a unique polyaromatic oligopeptide mainly composed of p-amino benzoic acids and cyano-alanine. Heterologous production and in-vitro studies of several domains of the non-ribosomal peptide synthetase rendered detailed insights into the biosynthetic machinery, revealing a comprehensive biosynthetic model for albicidin. Besides the main metabolite, we found several derivatives by non-targeted tandem mass spectrometry (MS/MS) experiments, for example an N-terminally carbamoylated version of albicidin. Carbamoyl-albicidin was characterized by high resolution MS/MS from cultures of X. albilineans and the putative biosynthesis confirmed by gene inactivation of the carbamoyltransferase, heterologous production of the carbamoyltransferase and in vitro reconstitution of the carbamoylation reaction. The chemical synthesis of both albicidin and carbamoyl-albicidin finally enabled us to assess their bioactivities by means of in vitro gyrase inhibition and antibacterial assays. Carbamoyl-albicidin showed stronger inhibitory effects against the gyrase compared to albicidin, which identifies the carbamoylation as an important biosynthetic step of albicidin maturation. In the second part of this work, the first application of top-down mass spectrometry in snake venomics is shown and discussed. In a case study with venom from king cobra, the application of top-down mass spectrometry enabled us to identify several proteins from different toxin families. Among those toxins are eleven three-finger toxins (7-7.9 kDa), a Kunitz-type inhibitor (6.3 kDa), ohanin (11.9 kDa), a novel phospholipase A2 molecule (13.8 kDa) and a cysteine-rich secretory protein (CRISP) ophanin (25 kDa). Complementary bottom-up MS/MS analyses contributed to complete a locus-resolved venom phenotypic map for Ophiophagus hannah, the world's largest venomous snake. As a first example for a viperid species we characterized the venom proteome Vipera anatolica, the Anatolian Meadow Viper by a combination of top-down and bottom-up venomics. From this analysis we identified snake venom metalloproteases, cysteine-rich secretory protein isoforms, a metalloprotease inhibitor, several type A2 phospholipases, disintegrins, a snake venom serine protease, a C-type lectin and a Kunitz-type protease inhibitor. Furthermore, we detected several isoforms of above mentioned proteins as well as previously unknown proteins, indicating an extensive complexity of the venom which would have remained undetected with conventional venomic approaches. With these results we could identify one of the bioactive fractions of the venom to be a hetero-dimeric disintegrin, which showed remarkable activity against cancer cells.
URI: http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/5368
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-5046
Exam Date: 5-Feb-2016
Issue Date: 2016
Date Available: 15-Mar-2016
DDC Class: DDC::500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
Subject(s): mass spectrometry
peptide
toxine
albicidin
snake venom
Massenspektrometrie
Peptid
Toxin
Albicidin
Schlangengift
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