Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-240
Main Title: Catalytic Center of [NiFe] Hydrogenases
Subtitle: EPR, ENDOR and FTIR Studies
Translated Title: Katalytisches Zentrum der [NiFe] Hydrogenasen
Translated Subtitle: EPR, ENDOR and FTIR Studien
Author(s): Trofantchouk, Olga
Advisor(s): Lubitz, Wolfgang
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: [NiFe] Hydrogenasen sind Metalloenzyme, die die reversible Umsetzung des molekularen Wasserstoffs katalysieren. Eine zentrale Rolle bei dieser Reaktion spielt das katalytische Zentrum, das in den [NiFe] Hydrogenasen einen heterobimetallischen Nickel-Eisen Komplex darstellt. Die Röntgenstrukturanalyse lieferte präzise Informationen über die atomare Struktur des katalytischen Zentrums in zwei [NiFe] Hydrogenasen. Der genaue Reaktionsmechanismus ist jedoch noch nicht aufgeklärt. Das katalytische [NiFe] Zentrum läßt sich in verschiedenen Redoxzuständen des Reaktionszyklus stabilisieren. In einigen von ihnen ist das Nickelion paramagnetisch, was den Einsatz von EPR-Techniken erlaubt. Das Eisenatom ist in allen Redoxzuständen des Enzyms diamagnetisch und somit für EPR-Techniken "unsichtbar". Fourier- Transform-InfraRot-Spektroskopie (FTIR) hat sich als empfindliches Verfahren für die Untersuchungen auch der diamagnetischen Zustände des katalytischen Zentrums in den [NiFe] Hydrogenasen, speziell der Umgebung des Eisen-Atoms, bewährt und wurde daher in dieser Arbeit auch eingesetzt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das katalytische Zentrum in den [NiFe] Hydrogenasen aus zwei verschiedenen Mikroorganismen: Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F und Acidithiobacillus ferooxidans untersucht. Beide Bakterien sind am Schwefel-Zyklus beteiligt. [NiFe] Hydrogenasen sind ein wichtiger Bestandteil des bakteriellen Metabolismus. Die [NiFe] Hydrogenase aus Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F gehört zu den "Standard" Hydrogenasen. Verschiedene Redox-Zustände dieses Enzyms wurden in der Proteinlösung und in den Einkristallen hergestellt und mittels EPR-Spektroskopie charakterisiert. Die Orientierung des g-Tensors relativ zu der atomaren Struktur wurde sowohl im oxidierten (Ni-A und Ni-B) als auch im reduzierten (Ni-C) Zustand der Hydrogenase bestimmt. Diese Studien liefern räumliche Informationen über die elektronische Struktur des aktiven Zentrums. Diese Ergebnisse sind eine Voraussetzung für ENDOR Experimente zur Lokalisierung der Protonen in der Umgebung des aktiven Zentrums und Bestimmung der Substrat-Bindungsstelle(n). ENDOR Messungen am Ni-B Zustand der D. vulgaris Hydrogenase ermöglichten eine Zuordnung von zwei beta-CH2-Protonen des Cysteinliganden am Nickel. Der aktive (Ni-C) Zustand wurde durch die Reduktion mit dem natürlichen Substrat Wasserstoff erzeugt. In diesem Zustand wurde die Spin-Spin Kopplung des NiFe Zentrums zum benachbarten Eisen-Schwefel-Cluster nachgewiesen und analysiert. Die [NiFe] Hydrogenase aus Acidithiobacillus ferrooxidans wurde erst vor kurzem isoliert und gereinigt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Hydrogenase erstmals mit EPR- und FTIR-Spektroskopie untersucht. Es wurde ein katalytisches [NiFe] Zentrum nachgewiesen, welches dem in den "Standard"-Hydrogenasen ähnelt. Verschiedene Redoxzustände des Enzyms wurden hergestellt und analysiert. Neben den für die "Standard"- Hydrogenasen charakteristischen Eigenschaften zeigte die A. ferrooxidans einige Besonderheiten wie z.B. die Lichtempfindlichkeit des oxidierten Zustandes. Dieser Effekt könnte durch die Existenz eines photolabilen Liganden in der verbrückenden Position zwischen dem Nickel und dem Eisen erklärt werden. Die Spin-Spin Kopplung zu einem benachbarten paramagnetischen Zentrum wurde ebenfalls im oxidierten Zustand des Enzyms beobachtet. Die Analyse der Aminosäurensequenz zeigte eine mögliche Abweichung in der Anordnung der Kofaktoren, die diese Wechselwirkung zustande kommen läßt. Die Auswertung der erhaltenen experimentellen Daten liefert einen Beitrag zum Verständnis der Struktur- Funktionsbeziehungen und des Reaktionsmechanismus in den [NiFe] Hydrogenasen aus verscheidenen bakteriellen Organismen.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-1422
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/537
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-240
Exam Date: 19-Dec-2000
Issue Date: 30-May-2001
Date Available: 30-May-2001
DDC Class: 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Subject(s): EPR
G-Tensor
Hydrogenase
Katalytisches Zentrum
Nickel
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