Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-5134
Main Title: Response of Escherichia coli processes for the production of heterologous inclusion bodies by oscillating cultivation conditions in a scale-down bioreactor
Translated Title: Reaktion von Escherichia coli-Prozessen zur Herstellung von heterologen Inclusion Bodies unter oszillierenden Kultivierungsbedingungen in einem Scale-down Bioreaktor
Author(s): Lu, Ping
Advisor(s): Neubauer, Peter
Referee(s): Neubauer, Peter
Schweder, Thomas
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: en
Abstract: In the pharmaceutical, chemical and food industries, microorganisms are widely cultivated under controlled conditions to produce recombinant proteins and organic molecules. However, inhomogeneities unavoidably exist in large-scale cultivations. The high concentration of feeding solution in industrial cultivations, combined with limitation of mixing power, results in excess substrate and oxygen limitation at the feeding zone. On the contrary, at other regions which are far away from the feeding zone, cells are exposed to starvation where there is almost no substrate available. In order to study the cellular responses to oscillations of substrate and oxygen availability in Escherichia coli industrial large-scale fed-batch bioprocesses at the laboratory scale, not only a two-compartment scale-down bioreactor (2CR) that simulates the feeding zone characterized by a high substrate and low oxygen availability, but also a three-compartment scale-down bioreactor (3CR) that mimics additionally a zone of low substrate availability was used in this study. With the help of the scale-down bioreactors, E. coli K-12 W3110 wild-type strain and two recombinant strains expressing leucine-rich proteins were cultivated to investigate the influence of heterogeneous condition on production and integration of the non-canonical amino acids norvaline, norleucine and β-methylnorleucine into recombinant proteins. The results showed a diminished productivity of recombinant strains in the first few hours after induction under oscillating conditions. The accumulation and misincorporation of non-canonical amino acids, especially norleucine, into recombinant proteins is affected by oscillating conditions. Though there are much less methionine residues in both recombinant proteins, norleucine was observed misincorporated into proteins with higher rate than norvaline and β-methylnorleucine. The main carbon source for α-ketobutyrate, which is the precursor of the considered non-canonical amino acids and isoleucine derived from threonine under normal conditions, while it is directly derived from pyruvate under oscillation conditions. This study provides a solid basis for future cell engineering approaches to overcome the challenges in view of the production quality.
Die Kultivierung von Mikroorganismen unter kontrollierten Bedingungen zur Produktion von rekombinanten Proteinen und anderen organischen Molekülen ist weit verbreitet sowohl in der pharmazeutischen und chemischen als auch in der Lebensmittelindustrie. Obwohl kontrolliert lassen sich Inhomogenitäten in Kultivierungen unter Industriemaßstab nicht vermeiden. Die hohe Konzentration der eingesetzten Feeding-Lösung in Verbindung mit limitierter Mischleistung führt zu Substrat-Überschuss und Sauerstoff-Limitation im Bereich der Zufütterung. Gleichzeitig erfahren Zellen in Bereichen entfernt der Zufütterungsstelle Hungerbedingungen ohne verfügbares Substrat. Um die zellulären Reaktionen auf diese Oszillationen hinsichtlich Substrat- und Sauerstoffverfügbarkeit in industriellen Großmaßstabs-Bioprozessen mit Escherichia coli im Labormaßstab untersuchen zu können, wurden ein Zwei-Kompartiment scale-down Bioreaktor (2CR), der einen Fütterungsbereich mit hoher Substrat- und niedriger Sauerstoffverfügbarkeit simuliert, sowie ein Drei-Kompartiment scale-down Bioreaktor (3CR), der zusätzlich eine Zone mit geringer Substratverfügbarkeit darstellt, eingesetzt. In diesen Scale-down-Systemen wurde der Einfluss von inhomogenen Kultivierungsbedingungen auf die Produktion der nicht-kanonischen Aminosäuren Norvalin, Norleucin und β-methylnorleucin in einem E. coli W3110 Wildtyp sowie zwei rekombinanten Derivaten untersucht. Gleichzeitig wurde überprüft, ob und in welcher Menge Fehleinbau dieser nicht-kanonischen Aminosäuren in die produzierten Leucin-reichen rekombianten Proteine erfolgte. Die Studien zeigten eine reduzierte Produktivität der rekombinanten Stämme innerhalb einigen Stunden nach der Induktion unter oszillierenden Bedingungen. Auch die Akkumulation und der Fehleinbau von nicht-kanonischen Aminosäuren in die rekombinanten Proteine, speziell Norleucin, ist durch oszillierende Kultivierungsbedingungen beeinflusst. Obwohl Methionin als Tauschpartner am geringsten in beiden rekombinanten Proteinen vorkommt, zeigte Norleucine im Vergleich zu Norvalin und β-methylnorleucin die höchste Fehleinbaurate. Als Quelle für α-ketobutyrat, das Ausgangsmolekül für die genannten nicht-kanonischen Aminosäuren und Isoleucin, dient Threonin unter normalen Kultivierungsbedingungen, während es unter oszillerenden Bedingungen aus Pyruvat abgeleitet wird. Diese Arbeit bildet eine gute Basis für zukünftige Stammverbesserungen, um Probleme und Herausforderungen in Bezug auf Produktqualität zu überwinden.
URI: http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/5463
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-5134
Exam Date: 15-Mar-2016
Issue Date: 2016
Date Available: 23-May-2016
DDC Class: DDC::600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::620 Ingenieurwissenschaften::620 Ingenieurwissenschaften und zugeordnete Tätigkeiten
Subject(s): scale-down
large-scale
non-canonical amino acids
recombinant proteins
misincorporation
Industriemaßstab
nicht-kanonische Aminosäuren
rekombinante Proteine
Fehleinbau
Sponsor/Funder: DFG, NE 1360/2-1, Metabolic responses to bioreactor inhomogeneities: Understanding the flux to modified branched chain amino acids
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