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Main Title: Investigation of the NADH/NAD+ state in Ralstonia eutropha H16 using the fluorescence reporter protein Peredox and Synthesis strategies of RNase A by splicing chemistry of DnaE Inteins
Translated Title: Untersuchung des NADH/NAD+ Redox Zustands unter Einsatz des Fluoreszenz-Sensorproteins Peredox in Ralstonia eutropha H16 und Synthesestrategien für RNase A durch Teilung mit DnaE Inteinen
Author(s): Tejwani, Vijay
Advisor(s): Friedrich, Thomas
Referee(s): Friedrich, Thomas
Fendler, Klaus
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: en
Abstract: Project 1: Ralstonia eutropha, a Gram-negative proteobacterium is equipped with the cellular machinery to survive solely in presence of H2, CO2 and O2. Interestingly, hydrogenase present in cytoplasm directly links H2 oxidation to the reduction of NAD+ to NADH (or H2 formation to the oxidation of NADH to NAD+), making the cellular NADH/NAD+ redox couple the most critical metabolic parameter for H2 production. The NADH/NAD+ cofactor pair plays a major role in microbial catabolism. Peredox is a fluorescent biosensor developed to report different cytosolic NADH/NAD+ redox states in mammalian cells. The aim of the present study was to test the potential of Peredox to report different NADH/NAD+ redox states in R. eutropha. Quantitative knowledge about different NADH/NAD+ redox states in R. eutropha can aid to optimize the use of this organism in biotechnology. Purified Peredox-mCherry sensor characterized ratiometrically is sensitive to NADH in presence of low (80 µM) and high (3mM) NAD+. The sensor shows no response to NAD+ but NAD+ competes with binding of NADH to the sensor. Its fluorescence lifetime was found to be a less sensitive indicator for changes in R’ values [(NADH*1000)/(NAD+)]. The sensor is expressed well in R. eutropha but its response could not be calibrated to external metabolites like lactate, pyruvate, fructose, NADH and NAD+. The sensor’s response could be calibrated to different R’ value in the cell lysate which proves that unresponsiveness of sensor on metabolic perturbations is due to its saturation with NADH inside R. eutropha. Based on the data, an R’ value of 20 or more is suggested to be present inside R. eutropha. Project 2: Bovine Ribonuclease A (RNase A), a commercially important enzyme contains multiple disulfide bonds, and its expression in the cytosol of Escherichia coli is problematic owning to its cytotoxicity and its tendency to form inclusion bodies. Several split DnaE inteins, present as two fragments have been recently shown to perform efficient protein ligation. Upon association the split intein pair undergoes rapid protein trans splicing (PTS), a process wherein the intein pair excises itself out of the association, joining the adjacent amino acids on both side of the intein pair by a peptide bond. Engineered split inteins fused to a protein can act as cis splicing inteins and efficiently generate C terminal α-thioesters as required in expressed protein ligation (EPL). In this project, synthesis of RNase A from two inactive fragments were tested using protein ligation based on trans (Strategy 1) and cis (Strategy 2) splicing DnaE inteins. RNase A halves, RNase A(1-64) and RNase A(65-124) were found to be soluble, but when fused with respective split DnaE inteins CwaN, CraN, CwaC, AvaC and CraC (except AvaN) as required in Strategy 1 were found to be expressed in an insoluble form in tested six E. coli strains. Although fusion of inteins, Ava and Npu engineered for generation of C terminal α-thioesters, improved the solubility of the previously insoluble RNase A(1-109) fragment, the fusion proteins showed poor thiolysis efficiency. The insolubility problem faced in Strategy 1 and the poor thiolysis observed in Strategy 2 makes both protein ligation schemes based on DnaE inteins unattractive for synthesis of RNase A.
Project 1: Ralstonia eutropha, ein Gram-negatives Proteobakterium kann in Gegenwart von H2, CO2 and O2 autotroph wachsen. Interessanterweise ist die Oxidation von H2 durch die Hydrogenase direkt mit der Reduktion NAD+ zu NADH gekoppelt, was das zelluläre Redoxpaar NADH/NAD+ zum kritischsten metabolischen Parameter für die H2 Produktion macht. Der NADH/NAD+ Kofaktor spielt eine bedeutende Rolle im mikrobiellen Katabolismus. Peredox ist ein fluoreszenter Biosensor, der entwickelt wurde, um verschiedene metabolische Redoxzustände von NADH/NAD+ in tierischen Zellen zu messen. Die Intention der vorliegende Studie bestand in der Analyse des Potenzials von Peredox, verschiedene NADH/NAD+ Redoxzustände in R. eutropha zu messen. Quantitative Kenntnis verschiedener NADH/NAD+ Redoxzustände in R. eutropha können bei der Optimierung der Nutzung dieses Organismus in der Biotechnologie hilfreich sein. Der aufgereinigte Peredox-mCherry Sensor, der ratiometrisch charakterisiert wurde, ist sensitiv auf NADH bei niedrigen (80 µM) und hohen (3mM) Konzentrationen an NAD+. NAD+ beeinflusst dabei nicht die Antwort des Sensors aber es beeinflusst die Bindung von NADH kompetitiv. Die Fluoreszenzlebensdauer von Peredox wurde als weniger sensitiver Indikator für das Verhältnis NADH/NAD+ bzw. die R’ Werte [(NADH*10)/(NAD+)] bewertet. Der Sensor wurde in R. eutropha gut exprimiert, aber seine Antwort konnte nicht auf externe Metabolite wie Laktat, Pyruvat, Fruktose, NADH, NAD+ und H2 kalibriert werden. Die Antwort des Sensors konnte auf verschiedene R’ Werte im Zelllysat kalibriert werden, was beweist, dass die fehlende Antwort des Sensors auf metabolische Störungen durch die Sättigung mit NADH in R. eutropha verursacht wird. Basierend auf diesen Daten wurde ermittelt, dass der R’ Wert in R. eutropha bei 20 oder mehr liegt. Projekt 2: Bovine Ribonuclease A (RNase A), ein kommerziell bedeutendes Protein, enthält zahlreiche Disulfidbindungen und seine Expression im Cytosol von Escherichia coli ist problematisch aufgrund seiner Cytotoxizität und seiner Tendenz Inklusionskörperchen zu bilden. Es wurde kürzlich gezeigt, dass mehrere DnaE Splitinteine, die als zwei Fragmente vorliegen, effizient eine Proteinverbindung eingehen können. Während der Assoziation vollzieht das Split Inteinpaar schnelles Protein trans splicing (PTS), ein Prozess, bei dem das Inteinpaar sich selbst aus der Assoziation herausschleust und angrenzende Aminosäuren an beiden Seiten des Inteinpaares durch Peptidbindung verbindet. Künstlich hergestellte Splitinteine, die an ein Protein fusioniert wurden, können als cis splicing Inteine fungieren und effizient C terminal. In diesem Projekt wurde die Synthese der RNase A aus zwei inaktiven Fragmenten unter Verwendung der Proteinverbindung, die auf trans (Strategie 1) und cis (Strategie 2) Splicing DnaE Inteinen beruht. Es wurde festgestellt, dass die RNase A Hälften, RNase A(1-64) and RNase A(65-124) löslich sind aber mit den DnaE Inteinen CwaN, CraN, CwaC, AvaC und CraC (erwartbar AvaN) wie in Strategie 1 erfordert als unlösliche Form exprimiert wurde wie in sechs E. coli Stämmen getestet wurde. Obgleich die Fusion von Inteinen, Ava und Npu, die für die Generierung C terminaler α-thioester hergestellt wurden, die Löslichkeit der unlöslichen RNase A(1-109) verbesserte, hatten die Fusionsproteine schlechte Thiolyseeffizienz. Das Unlöslichkeitsproblem, das in Strategie 1 auftrat und die schwache Thiolyse, die in Strategie 2 beobachtet wurde, macht das Bindungsschema, das auf DnaE Inteinen beruht, unattraktiv für die Synthese der RNase A.
Exam Date: 30-Jun-2016
Issue Date: 2016
Date Available: 21-Jul-2016
DDC Class: 572 Biochemie
Subject(s): fluorescence biosensor
split inteins
protein ligation
Ribonuclease A
Ribonuklease A
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