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Main Title: Gen- und verfahrenstechnische Ansätze zur Optimierung von Aspergillus niger als Expressionsplattform
Translated Title: Engineering approaches to improve Aspergillus niger as expression platform
Author(s): Wanka, Franziska
Advisor(s): Meyer, Vera
Referee(s): Meyer, Vera
Neubauer, Peter
Gossen, Manfred
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: de
Has Part: 10.14279/depositonce-5434
10.14279/depositonce-5435
Abstract: Aspergillus niger has the ability to synthesise large amounts of acids and proteins, and to secrete these into the environment. This particular property is used in biotechnology to produce platform chemicals and industrial enzymes. Despite impressive metabolic activities, there is still a need for research to optimise product yields of A. niger using genetic and engineering approaches. This work therefore focuses on using genetic approaches to adapt synthetic gene switches, such as tetracycline-dependent systems (Tet-on and -off), and evaluate their applicability in A. niger. It was successfully demonstrated that pharmacologically interesting secondary metabolites, such as the non-ribosomal cyclodepsipeptide enniatin under the control of the Tet-on system can be produced in economically relevant amounts (g/l) in fed-batch cultivation of A. niger. Furthermore, there has been success in establishing a genetically stable variant of the Tet-off system in A. niger. A particular challenge hereby is the validation of the most appropriate transactivator variant and their transcriptional expression strength. The use of a promoter with moderate activity enabled stable expression of the toxic transactivator in the genome of A. niger. The functional and quantitative analysis and validation of the new Tet-off system was carried out based on three genes. Stable and inducible gene switches are thus now available which will contribute to the elucidation and optimization of metabolic pathways in Aspergillus in the future. Secondly, the objective of this work was to determine autoinducible promoters that are active at low growth rates, in order to achieve the continuous perfusion for the production of extracellular heterologous proteins in A. niger. Two suitable promoters (anafp, hfbD) were identified with the aid of transcriptomic data, and their promoter activities were validated with an intracellular reporter (luciferase) and a heterologous extracellular antifungal protein (AFP) in 14 days of perfusion cultivations. The two promoters examined differed in regards to expression level and temporary activity, whereas the anafp promoter results in a very high but peak-like result, and the hfbD promoter a constant, yet moderate expression. Likewise, the respective secretion signal sequences of anafp and hfbD genes proved their functionality by successful secretion of the heterologous protein. Systematic analysis and adaptation of new autoinducible promoters for perfusion cultivation of A. niger thus create an appropriate molecular genetic basis for future continuous processes in fungal biotechnology.
Aspergillus niger besitzt die Fähigkeit, große Mengen an Säuren und Proteinen zu synthetisieren und in die Umwelt auszuscheiden. Diese besondere Eigenschaft wird biotechnologisch genutzt, um sowohl Plattformchemikalien als auch industrielle Enzyme herzustellen. Trotz beeindruckender Stoffwechselleistungen, gibt es weiterhin Forschungsbedarf, um die Produktausbeuten von A. niger mit Hilfe von gen- und verfahrenstechnischer Methoden zu optimieren. Diese Arbeit fokussierte sich daher zum einen auf gentechnische Ansätze, um synthetische Genschalter, wie Tetracyclin-abhängige Systeme (Tet-on und -off), an A. niger zu adaptieren und ihre Anwendbarkeit zu evaluieren. Es konnte erfolgreich gezeigt werden, dass pharmakologisch interessante Sekundärmetabolite, wie das nicht-ribosomale Cyclodepsipeptid Enniatin, in A. niger unter Regulierung des Tet-on-Systems in wirtschaftlich relevanten Mengen (g/l) in Fed-Batch-Fermentationen produziert werden können. Des Weiteren gelang es, eine genomisch stabile Variante des Tet-off-Systems für A. niger zu etablieren. Eine besondere Herausforderung stellte hierbei die Validierung der am besten geeignetsten Transaktivatorvariante und deren transkriptionelle Expressionsstärke dar. Die Verwendung eines Promotors mit moderater Aktivität ermöglichte eine stabile Expression des toxischen Transaktivators im Genom von A. niger. Die funktionale und quantitative Analyse und Validierung des neuen Tet-off-Systems wurde anhand dreier Gene durchgeführt. Somit stehen nun stabile und induzierbare Genschalter zur Verfügung, die zukünftig zur Aufklärung und Optimierung metabolischer Stoffwechselwege in Aspergillus beitragen werden. Zum anderen war es das Ziel dieser Arbeit, autoinduzierbare Promotoren zu ermitteln, die bei geringer Wachstumsrate aktiv sind, um die kontinuierliche Perfusionsfermentation zur Produktion extrazellulärer heterologer Proteine in A. niger nutzbar zu machen. Es wurden mit Hilfe von Transkriptomanalysen zwei geeignete Promotoren (anafp, hfbD) identifiziert, deren Promotoraktivitäten mit einem intrazellulären Reportergen (Luziferase) und ebenso mit einem heterologen extrazellulären, antifungal wirkenden Protein (AFP) in 14-tägigen Perfusionskultivierungen validiert. Beide Promotoren unterscheiden sich bezüglich der Expressionsstärke und des temporären Verlaufes, wobei der anafp-Promotor eine sehr hohe aber peakartige und der hfbD-Promotor eine konstante aber moderate Expression vermittelt. Ebenso konnten die jeweiligen Sekretionssignalsequenzen der anafp und hfbD Gene ihre Funktionalität durch erfolgreiche Sekretion des heterologen Proteins unter Beweis stellen. Die systematische Analyse und Anpassung neuer autoinduzierbarer Promotoren an die Perfusionskultivierung von A. niger legt somit eine geeignete molekulargenetische Grundlage für zukünftige kontinuierliche Prozesse in der Pilzbiotechnologie.
URI: http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/5814
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-5419
Exam Date: 11-May-2016
Issue Date: 2016
Date Available: 1-Aug-2016
DDC Class: DDC::500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): Aspergillus niger
Expressionssysteme
Sekundärmetabolite
Heterologe Expression
Tet-on
Tet-off
Retentostat-Kultivierung
expression systems
secondary metabolite
heterologous expression
retentostat cultivation
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