Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-5442
Main Title: Investigations on the mobility of the Na,K-ATPase in cell membranes probed by fluorescence microscopy
Translated Title: Untersuchungen zur Mobilität der Na,K-ATPase in Zellmembranen mittels Fluoreszenzmikroskopie
Author(s): Junghans, Cornelia
Advisor(s): Friedrich, Thomas
Referee(s): Friedrich, Thomas
Koenderink, Jan
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: en
Abstract: The Na,K-ATPase is a plasma membrane ion transporting enzyme, which is of high physiological importance especially in excitable cells of the central nervous system. It converts the energy from ATP hydrolysis to electrochemical gradients of Na+ and K+ ions across the cell membrane. The enzyme transports three sodium ions out of the cell and two potassium ions into the cell for each hydrolyzed ATP molecule. Mutations in genes coding for Na,K-ATPase isoforms lead to severe human pathologies like familial hemiplegic migraine (FHM), alternating hemiplegia of childhood (AHC) or epilepsy. Many of the reported mutations lead to loss-of-function effects on the molecular level, but others do not alter the function of the enzyme. Instead, to e.g. reduced protein stability, reduced protein expression or defective cellular localization may result. Therefore, the overall understanding of the implementation of the Na,K-ATPase into the plasma membrane is of great interest. By mutational disruption of binding sites of the Na,KATPase with ankyrin B (NaK-K456E) and caveolin-1 (NaK-ΔC, NaK-ΔN) it could be expected to observe changes in the plasma membrane targeting of the enzyme and changes of the localization within the plasma membrane and, consequently, of the diffusion behavior of the enzyme. The diffusion behavior of the different Na,K-ATPase constructs in the plasma membrane of living HEK293T cells was studied with fluorescence correlation spectroscopy (FCS) and as well with fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). Both methods require labeling of the observed proteins with suitable fluorescent markers. Since from the literature it is known that common genetically encoded fluorescent proteins, e.g. eGFP, lead to artifacts in diffusion studies by FRAP due to photoswitching, the reversibly photoswitchable fluorescent protein Dreiklang (DRK) was used in addition as fluorescent marker. FCS studies on the Na,K-ATPase labeled with DRK lead to the conclusion that DRK is unsuitable for FCS analysis. It seems that DRK undergoes photophysical quenching processes, which occur on the same time scale as the observed diffusion times and, thus, small differences in diffusion are not measurable. The different Na,K-ATPase mutants labeled with eGFP exhibit significant differences in the diffusion behavior within the plasma membrane compared with the Na,K-ATPase wild-type. FRAP measurements on the Na,K-ATPase labeled with eGFP do not show significantly different results, but affirm the problems mentioned above. On the other side, DRK as fluorescence marker studied with standard FRAP settings also exhibits artificially shortened diffusion components, which can be attributed to reversible photoswitching of the fluorescent proteins and, therefore, these data are biased by photophysical artifacts. This problem is overcome by reversible FRAP experiments with DRK as fluorescence marker. However, these reversible FRAP data should be considered as a first qualitatively result and gives a hint about the different diffusion behavior of the various Na,K-ATPase constructs, because a thermically reactivation of the OFF-switched proteins into the ON-state is possible. These measurements open another view on the study of the implementation of the Na,KATPase into the plasma membrane and provides the opportunity to gain a deeper understanding of the binding or fixation of this enzyme within the membrane. FCS measurements can be therefore used in future investigations on Na,K-ATPase mutants linked to several diseases.
Die Natrium-Kalium-ATPase (Na,K-ATPase) ist eine spannungsabhängige Ionenpumpe und eines der bedeutendsten Membrantransport-Proteine, welche insbesondere in erregbaren Zellen des zentralen Nervensystems von hoher physiologischer Bedeutung sind. Die Na,K-ATPase transportiert, gegen den chemischen Konzentrationsgradienten unter ATP Hydrolyse, drei Natriumionen aus der Zelle und zwei Kaliumionen in die Zelle. Diese beiden Prozesse sind strikt aneinander gekoppelt und halten somit die elektrochemischen Gradienten für Na+- und K+-Ionen über die Plasmamembran der Zelle aufrecht. Mutationen in den Genen der verschiedenen Isoformen der Na,K-ATPase α-Untereinheit können zu schweren Erkrankungen wie familiärer hemiplegischer Migräne (FHM Typ 2), alternating hemiplegia of childhood (AHC) oder Epilepsie führen. Viele der bereits bekannten Mutationen führen zum Verlust ihrer Funktion auf molekularer Ebene, wohingegen andere die Funktion des Enzyms nicht verändern oder beeinflussen. Stattdessen verursachen diese Mutationen eine reduzierte Proteinstabilität, verringern die Proteinexpression oder führen zur defekten zellulären Lokalisation. In dieser Arbeit wurden verschiedene Mutationen in der Na,K-ATPase α2-Untereinheit untersucht, die mit der Bindung der Na,K-ATPase an andere membranständige Proteine, wie z.B. Caveolin-1 (NaK-ΔC, NaK-ΔN), oder an Bindungsproteine des Zytoskeletts, wie Ankyrin B (NaK-K456E) assoziiert werden sowie der Fixierung innerhalb der Plasmamembran dienen. Es wird angenommen, dass diese Mutationen zu veränderter Zielsteuerung des Enzyms, Veränderung der Lokalisierung in der Plasmamembran und damit zur Änderung des Diffusionsverhaltens des Enzyms führen. Das Diffusionsverhalten der verschiedenen Konstrukte in der Plasmamembran von lebenden HEK293 Zellen wurde mit zwei verschiedenen Messtechniken untersucht, zum einen mit der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) und zum anderen mit Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP). Beide Verfahren erfordern die Markierung der zu beobachtenden Proteine mit geeigneten Fluoreszenzmarkern. Da in der Literatur beschrieben ist, dass genetisch kodierte Fluoreszenzproteine wie das grün fluoreszierende Protein (GFP) zu Artefakten durch Photoschalten in FRAP-Messungen führen, wurde außerdem das reversibel schaltbare Dreiklang Protein (DRK) als Marker verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass DRK als Marker für FCS-Messungen nicht geeignet ist, da das Protein unbekannte photophysikalische Prozesse durchläuft, welche sich auf der gleichen Zeitskala, wie die zu erwartenden Diffusionsänderungen, abspielen und somit diese überlagern. Die verschiedenen eGFP-Na,K-ATPase Mutanten zeigten im Vergleich zum Wildtyp signifikante Unterschiede bei FCS-Messungen. Alle Mutanten wiesen eine deutlich schnellere Diffusion auf als der Wildtyp, was auf eine gelockerte Bindung an der Membran zurückgeführt werden kann. FRAP-Messungen unter Verwendung von eGFP als Fluoreszenzmarker zeigten deutlich eine sehr schnelle Diffusionskomponente, welche auf das reversible Photoschalten der Proteine zurückzuführen ist und damit die Messung für kleine Unterschiede im Diffusionsverhalten unmöglich machen. Die gleichen Ergebnisse wurden auch für DRK markierte Zellen unter Standard FRAP Bedingungen beobachtet. Dieses Problem konnte mit Hilfe von reversiblen FRAP-Messungen umgangen werden, indem DRK in seinen ausgeschalteten Zustand gebracht wurde, anstatt DRK irreversibel zu bleichen. Anhand dieser Messungen konnten signifikante Unterschiede der DRK-Na,K-ATPase Mutanten im Vergleich zum Wildtyp beobachtet werden. Es muss aber hier angemerkt werden, dass diese Messungen nur als qualitative Untersuchung angesehen werden können, da DRK durch thermische Reaktivierung wieder in den eingeschalteten Zustand zurückkehren kann und dieser Prozess die zu beobachtenden Diffusionsprozesse überlagert. Die in dieser Arbeit durchgeführten Messungen eröffnen eine neue Sichtweise für die Untersuchung der Na,K-ATPase und lassen Rückschlüsse auf die Fixierung innerhalb der Plasmamembran und die Bindung an andere Adapter- oder Matrixproteine zu. Dadurch kann in zukünftigen Untersuchungen die FCS Messtechnik genutzt werden um unbekannte Mutationen zu studieren, welche mit verschiedenen Krankheiten assoziiert werden und somit einen wertvollen Beitrag zur Erforschung deren Ursachen leisten können.
URI: http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/5840
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-5442
Exam Date: 19-Jul-2016
Issue Date: 2016
Date Available: 18-Aug-2016
DDC Class: DDC::500 Naturwissenschaften und Mathematik::540 Chemie::541 Physikalische Chemie
Subject(s): Na K-ATPase
membrane protein diffusion
fluorescence correlation spectroscopy
fluorescence recovery after photobleaching
plasma membrane
Plasmamembran
Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie
Diffusionsprozesse
Fluoreszenzmikroskopie
Creative Commons License: https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/
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