Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-294
Main Title: Biosynthese des Taxols: Klonierung und Expression des Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase-Gens aus Taxus baccata
Translated Title: Biosynthesis of Taxol: Cloning and expression of taxa-4(5),11(12)-diene synthase gene from Taxus baccata
Author(s): Görhardt, Bärbel
Advisor(s): Zocher, Rainer
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Taxol ist ein hochwirksames Antikrebsmittel gegen Brust- und Eierstockkrebs, das in geringen Mengen in der Rinde aller Taxus-Arten gefunden wird. Taxol stellt ein hoch funktionalisiertes cyclisches Diterpen dar, das durch chemische Synthese nur schwer zugänglich ist. Durch die begrenzte Verfügbarkeit von Taxol durch natürliche Ressourcen, ist es von großem biotechnologischem Interesse, die an der Biosynthese beteiligten Enzyme zu erforschen. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Klonierung und Expression des Taxa-4(5),11(12)-dien-Synthase-Gens aus der Europäischen Eibe Taxus baccata. Die Taxadien-Synthase stellt ein Schlüsselenzym in der Biosynthese des Taxols dar. Sie katalysiert die Cyclisierung des Diterpens Geranylgeranylpyrophosphat zu Taxa-4(5),11(12)-dien. Für die Charakterisierung des Taxadien-Synthase-Gens wurde dieses mittels PCR amplifiziert und in Escherichia coli kloniert. Die Sequenzanalyse des Gens ergab einen offenen Leserahmen von 3980 bp, bestehend aus 13 Exons und 12 Introns. Aus dem ORF lässt sich für die Taxadien-Synthase eine Größe von 98 kDa vorhersagen. Ein Sequenzvergleich mit verschiedenen pflanzlichen Isoprensynthasen zeigte eine hohe Übereinstimmung hinsichtlich der Intron/Exon-Struktur im C-terminalen Bereich, als auch das Vorhandensein eines, in allen verglichenen Isoprensynthasen vorhandenen, konservierten Motivs DDXXD. Interessanterweise weist die Isoprensynthase aus T. baccata höhere Ähnlichkeit im mittleren Bereich der Gen-Struktur zu der Linalool-Synthase, eine Hydroxylase, aus Clarkia concinna auf als zu den anderen Isoprencyclasen. Der N-terminale Bereich der Isoprensynthase-Gene zeichnet sich durch eine hohe Variabilität aus, da dieser Bereich für das Signalpeptid codiert, das für den Transport der Synthasen in die jeweiligen Plastide zuständig ist. Für die Expression der rekombinaten Synthase in E. coli wurde mittels RT-PCR die entsprechende cDNA isoliert, und anschließend das Protein durch Affinitäts-Chromatographie an Nickel-Agarose angereinigt. Die Ausbeute an Taxadien-Synthase betrug 20 mg/l Kulturmedium. Durch Western Blot-Analyse mit Antikörpern sowohl gegen His5-Tag als auch gegen ein Peptid aus der Taxadien-Synthase und durch GC-MS-Analyse konnte das funktionale Enzym nachgewiesen werden. Mittels SDS-PAGE unter denaturierenden Bedingungen konnte für die rekombinante Taxadien-Synthase ein Molekulargewicht von 97 kDa bestimmt werden. Im Gegensatz dazu ist für das native Protein aus T. brevifolia eine Größe von 80 kDa beschrieben worden. Diese Diskrepanz lässt den Schluss zu, dass das rekombinante Protein (Preprotein) aus einem Transitpeptid für das Plastid und der eigentlichen Isoprensynthase besteht. Ein Vergleich der Aminosäure-Sequenzen der Taxadien-Synthasen aus T. baccata, T. brevifolia und T. chinensis zeigt, dass der Verwandtschaftsgrad der Synthasen aus T. baccata und T. brevifolia untereinander höher ist als zu der Taxadien-Synthase aus T. chinensis.
Taxol is a highly potent antitumor drug with activity against breast and ovarian cancer. It can be found in small amounts in the bark of Taxus species. Taxol represents a highly functionalized cyclic diterpene. The yields by total synthesis are too low to be commercially viable. Due to the limited supply of the drug from its natural ressources it is of highly biotechnological interest to study the enzymes involved in taxol biosynthesis. The present work deals with the cloning and expression of the taxa-4(5),11(12)-diene synthase gene from European yew (Taxus baccata). Taxadiene synthase is a key enzyme in taxol biosynthesis. It catalyzes the cyclization of geranylgeranyl diphosphate to form taxa-4(5),11(12)-diene. To characterize the taxadiene synthase gene it was amplified by PCR and cloned in Escherichia coli. Sequence analysis of the gene revealed an ORF of 3980 bp, consisting of 13 exons and 12 introns, predicting a molecular mass of 98 kDa for the enzyme. Sequence comparison with various plant terpene synthases showed high homology regarding the intron/exon structure at the C-terminal region as well as the presence of the conserved motif DDXXD which can be found in all cyclases compared. Interestingly, taxadiene synthase from T. baccata exhibits a higher degree of similarity (regarding the gene structure between exons 3-9) to linalool synthase from Clarkia concinna, than to terpene cyclases. The N-terminal parts of the terpene synthase genes are highly variable because this region encodes for the transit peptide necessary for localization of the enzymes to the corresponding plastids. For the expression of the recombinant synthase in E. coli the corresponding cDNA was isolated by RT-PCR. The protein was partially purified by affinity chromatography using NTA-Agarose. The yield of taxadiene synthase was 20 mg/l culture medium. The enzyme could be detected by Western Blot analysis using an anti His antibody and an antibody directed against an internal sequence of taxadiene synthase, respectively. In addition, taxadiene synthase activity was detected by GC-MS analysis. Using SDS Page a molecular mass of 97 kDa for the recombinant protein could be determined. In contrast a molecular mass of 80 kDa was found for the native taxadiene synthase from T. brevifolia. The difference of 17 kDa suggests the presence of a putative plastidial transit peptide at the N-terminus of the recombinant protein (preprotein). Amino acid sequence comparison between taxadiene synthases from T. baccata, T. brevifolia and T. chinensis shows that the synthases from T. baccata and T. brevifolia exhibit a higher degree of relationship to each other then to taxadiene synthase from T. chinensis.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-1966
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/591
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-294
Exam Date: 19-Jan-2001
Issue Date: 26-Feb-2001
Date Available: 26-Feb-2001
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): 11(12)-dien-Synthase
CDNA
Expression
Genomischer Klon
Taxa-4(5)
Taxus baccata
11(12)-diene synthase
CDNA
Expression
Genomic clone
Taxa-4(5)
Taxus baccata
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